复方黄连素片为中西药合方制剂,由4味药组成,具有清热燥湿、行气止痛、止痢止泻的功效。笔者通过资料库查找到一篇关于通过对多个企业生产的多批次复方黄连素片微生物限度检查法进行验证,确定了该品种微生物限度检查法,同时对26个生产企业198个批次的复方黄连素片进行微生物限度检查,并对检验结果进行分析讨论,实验结果理想,希望能给相关制药厂提供参考。
1 仪器与材料
1.1 仪器
BSC-1500A2-X型生物洁净安全柜(济南鑫贝西生物技术有限公司) ; HTY-2000B 型集菌仪(杭州泰林生物技术设备有限公司) ; GHP-9270 型隔水式恒温培养箱( 上海一恒科技有限公司) ; MJ-250I 型霉菌培养箱( 上海一恒科技有限公司)
1. 2 样品
本试验所用样品复方黄连素片来自 26 个生产企业198 个批次
1.3 培养基和稀释液
营养肉汤培养基、改良马丁培养基、营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、胆盐乳糖培养基本、4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基( MUG)、乳糖胆盐发酵培养基。稀释液:pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液。
1.4 菌种
金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、白色念珠菌黑曲霉。
2.1 菌液的制备
按照中国药典2010 年版一部附录要求制备
2. 2 供试液的制备
取本品10 g,加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 mL,振摇,研磨,制成1∶10的供试液取1∶10的供试液1 mL,加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液9 mL,即为1∶100的供试液取1∶100的供试液1 mL,加入pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液9 mL,即为1∶1000的供试液。
2.3 细菌计数 霉菌和酵母菌计数验证实验方法
2.3.1 常规注皿法
组别 | 待测液 | 处理 | 测定菌落数 |
菌落组 | 菌液 | 注入平皿,加培养基培养 | A |
样品对照组 | 供试液+菌液 | 注入平皿,加培养基培养 | B |
验证组 | 供试液 | 注入平皿,加培养基培养 | C |
稀释剂对照组 | 稀释剂+菌液 | 注入平皿,加培养基培养 | D |
2.3.2 培养基稀释法
组别 | 待测液 | 处理 | 测定菌落数 |
菌液组 | 菌液 | 注入平皿,加培养基培养 | A |
样品对照组 | 供试品 | 注入平皿,加培养基培养 | B |
验证组 | 供试品+菌液 | 注入平皿,加培养基培养 | C |
稀释剂对照组 | 稀释剂+菌液 | 注入平皿,加培养基培养 | D |
2.3.3 薄膜过滤法
组别 | 待测液 | 处理 | 测定菌落数 |
菌落数 | 菌液 | 注入平皿,加培养基培养 | A |
样品对照组 | 供试品 | 供试品离心,取上清液用冲洗液冲洗3次,取出滤膜,进行培养 | B |
验证组 | 供试品+菌液 | 供试品离心,取上清液先用冲洗液冲洗2次,冲洗液加菌液冲洗一次,取出滤膜,进行培养 | C |
稀释剂对照组 | 稀释剂+菌液 | 稀释剂过滤,冲洗液冲洗2次、加菌液冲洗1次,取出滤膜,进行培养 | D |
2.4 计算
分别按如下公式进行计算:
验证组回收率(%):R1=(c-b)/a×100%
稀释剂对照组回收率(%):R2=d/a×100%
根据中国药典 2010 年版一部附录,若 R2 >70%,而且R1>70%,可认为该稀释液制备方法和计数方法可用于该样品的菌落计数;若使用的是中国药典收载的稀释剂,稀释剂对照组可不进行验证.
2.5 大肠埃希菌检查(直接接种法)验证试验
按照中国药典2010 年版一部,取1∶10的供试液10 mL, 加100 mL胆盐乳糖培养基中,培养,进行大肠埃希菌检查;另取1∶10的供试液10mL和大肠埃希菌液1 mL,加至100mL胆盐乳糖培养基中进行方法学验证, 判断是否检出大肠埃希菌 若验证组检出大肠埃希菌, 可认为该方法适用于复方黄连素片大肠埃希菌检查。
2.6 大肠菌群检查(直接接种法)验证试验
按照中国药典2010年版一部,按1∶10的供试液1mL1∶100的供试液1mL1∶1000的供试液1mL,分别加至10 mL 乳糖胆盐发酵培养基管中,培养,进行大肠菌群检查;另1∶10 的供试液1mL和大肠埃希菌液1mL,加至 10 mL 乳糖胆盐发酵培养基管中进行方法学验证,判断是否检出大肠菌群若验证组检出大肠埃希菌,可认为该方法适用于复方黄连素片大肠菌群检查。
3.1结果与讨论
分析过程略。
结果显示:用薄膜过滤法得出的验证菌的回收率较高,应采用薄膜过滤法对复方黄连素片进行细菌的计数。
大肠埃希菌和大肠菌群检查的验证结果表明可以采用直接接种法进行大肠埃希菌检查和大肠菌群检查。
3.2 微生物限度检查结果
复方黄连素片的微生物限度标准规定为1g供试品中,细菌数不得过10000cfu,霉菌和酵母菌数不得100cfu,大肠埃希菌不得检出,大肠菌群数应小于100个g-1。
采用验证后的微生物限度检查方法,对来自26个企业198个批次的复方黄连素片样品进行检验,结果均符合规定,其中霉菌和酵母菌数均小于10cfu.g-1,大肠埃希菌均未检出,大肠菌群数均小于10个g- 1, 细菌数在10 cfu.g- 1x<100 cfu.g- 1和 100 cfu.g-1x<1000 cfu.g-1的样品分别占到总数的10.6%和 3. 5%,其他样品均小于10cfu.g-1,且细菌数最高的也没有超过1000cfu.g-1,远小于10000 cfu.g-1的限度要求。
4、复方黄连素片微生物限度检查方法的确定
取本品10 g,加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 mL,振摇,研磨,制成1∶10的供试液取1∶10的供试液1mL,加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液9 mL,即为1∶100的供试液,取1∶100的供试液1mL,加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液9 mL,即为1∶1000的供试液。细菌计数,取1∶10的供试液,500r.min-1离心3 min,将全部上清液混合后取1mL过滤,用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜,每次100mL.膜-1,共3次,依法检查; 霉菌和酵母菌计数,取1∶10的供试液1 mL,分别注入5个平皿中,每皿中0.2 mL,依法检查;大肠埃希菌检查,取1∶10的供试液10 mL,依法检查;大肠菌群检查,分别取1∶10的供试液1 mL1∶100的供试液1mL1∶1000的供试液1mL, 依法检查。