目前，合欢花总黄酮的含量测定方法多采用紫外分光光度法， 但显色方法不尽相同，高 效液相方法多以测定槲皮苷含量为主，本实验建立了合欢花总黄酮的液相测定方法和紫外测定方法，并比较二者的差异，以探讨准确测定合欢花中总黄酮的快速简便方法。
1、 实验准备
设备：高效液相色谱仪、紫外可见分光光度计、减压干燥箱、微孔滤膜过滤器、乙腈、甲醇；
试剂：合欢花、槲皮素
2、 紫外分光光度法测定总黄酮
2.1对照品溶液配制 精密称取干燥的槲皮苷对照品10.27mg，置10mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，制成质量浓度为1.027mg /mL的标准品储备液量取1mL上述标准品储备液，置10mL容量瓶中定容，制成质量浓度为0.1027mg /mL 的对照品溶液，摇匀，备用。
2.2供试品溶液的制备 称取合欢花粗粉25.00g，加12倍量70%乙醇，加热回流提取2次，每次提取2h，合并提取液，减压浓缩后，置50mL容量瓶中定容将合欢花提取液上样于处理好的NKA9型大孔树脂，分别以4BV 纯水4BV10%乙醇冲洗，4BV 70%乙醇洗脱，收集洗脱液回收溶剂，浓缩至50mL，即得生药量为 0.5g /mL的合欢花总黄酮溶液。
精密移取 5mL生药量为 0.5g /mL的样品液，置50mL容量瓶中，甲醇定容至刻度 即为供试品溶液。
2.3测定波长的选择 精密移取0.1mL供试品于10mL容量瓶中加 5%AlCl3 1mL 摇匀，放置 5min，加甲醇至刻度，摇匀后放置5min，在波长200～600nm范围内扫描结果表明，对照品和样品的显色液均在435nm处有最大吸收，因此选435nm为测定波长。
2.4线性关系考察
2.5精密度和稳定性考察
2.6重复性考察
2.7加样回收率考察
2.8样品测定 精密移取项下供试品溶液0.1mL，置10mL容量瓶中加5%AlCl3 1mL 摇匀，放置5min，加甲醇至刻度，摇匀后放置 5min，测定吸光度，测量三次，取平均值，代入公式， 计算供试品溶液的黄酮含量为1.4065mg /mL另取5mL供试品置干燥恒重的称量瓶中干燥至恒重，用减重法计算 5mL 供试品质量为 23.6mg 计算纯度为29.80% 计算公式如下:纯度(%) =供试品黄酮含量×供试品体积/供试品总质量×100%
3、HPLC测定总黄酮
3.1色谱条件
色谱柱为不锈钢柱; 流动相为乙腈: 水，梯度洗脱(水:乙腈，0～25min，乙腈20～23) ; 柱温25℃; 体积流量: 1．0mL /min; 紫外－可见光二极管阵列检测器( DAD)可测定不同紫外吸收波长，本实验经比较选取检测波长为360nm; 进样体积20μL
3.2对照品溶液的制备
从质量浓度为10.27mg /mL 的标准品储备液中精密移取5mL标准品，于10mL 容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，制得质量浓度为 0.5135mg /mL 的对照品溶液，摇匀、备用。
3.3 供试品溶液的配制
精密移取2.5mL生药量为0．5g/mL的样品液置50mL容量中，甲醇定容至刻度，移取适量样品液，微孔滤膜过滤，待用。
3.4线性关系考察
3.5精密度和稳定性考察
3.6重复性考察
3.7加样回收考察
3.8样品检测
移取供试品溶液适量，微孔滤膜过滤，置液相瓶中，重复测量3次，取平均值，带入公式，计算供试品溶液的黄酮含量为 0.6655mg /mL 纯度计算方法同， 供试品纯度为28.20%。
讨论
测定总黄酮的含量通常有两种方法: 紫外分光光度法和高效液相色谱法，两种方法各有所长。紫外分光光度法是测定总黄酮的主流方法， 有着操作方便不需要特定标准品等优点 但是紫外分光光度法的特征性不强，不同成分的紫外响应值差异较大，且标准品的选择对实验结果具有很大影响，所以普遍认为紫外分光光度法不能准确测定总黄酮的含量。高效液相色谱法的精密度、准确度和重复性均高于紫外分光光度法。但是中药成分复杂，分离条件较难摸索，且液相定量需要购买大量标准品，所以高效液相法测定接受度不高。合欢花黄酮有其特殊性，即黄酮类物质以槲皮苷为主因此在这里以槲皮苷为标准品，运用紫外分光光度法和高效液相色谱法均有其合理性紫外分光光度法测得的合欢花总黄酮含量以槲皮苷计为29．8%高效液相色谱法测得的合欢花总黄酮含量以槲皮苷计为 28．2% 紫外分光光度法略高于高效液相色谱法，分析原因可能是总黄酮中的其它黄酮，如槲皮素、异槲皮苷、木犀草素、芦丁等带来的测定差异但两种方法重复性高且相差小均能较客观的反映总黄酮的含量，因此紫外分光光度法可以代替高效液相色谱法对总黄酮进行快速的测定。