为进一步阐明拟修订的微生物限度检查法所具备的优点，本文拟采用两种中成药(灵芝孢子红景天胶囊和小蓟炭配方颗粒)与两种化学药(孟鲁司特钠颗粒和双氯芬酸钠贴片)，分别按照《中国药典》10年版方法和《中国药典》15年版通则公示稿中的微生物限度检查法进行方法学考察，以比较两种方法之间的差异。
1、实验准备
设备：生化培养箱、生物安全柜、电子天平、漩涡混合器、无菌检查仪、恒温水浴箱、水浴锅、
菌种：金黄色葡萄球菌 CMCC(B)26 003、大肠埃希菌CMCC(B)44 102、枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501、铜绿假单胞菌CMCC(B)10 104和 白色念珠菌CMCC(F)10 123均购自中国食品药品检定研究院;黑曲霉(ATCC16 404)购自广东省微生物研究所。
培养基：营养琼脂 玫瑰红钠琼脂、胰酪大豆胨琼脂、胰酪大豆胨液体、沙氏葡萄糖琼脂、沙氏葡萄糖液体营养肉汤、改良马丁、改良马丁琼脂， 胆盐乳糖、肠道菌增菌液体、紫红胆盐葡萄糖琼脂、麦康凯液体、麦康凯琼脂、溴化十六烷基三甲铵琼脂、甘露醇氯化钠琼脂 MUG 和曙红亚甲蓝琼脂培养基
供试液的制备：取灵芝孢子红景天胶囊内容物10 g，加 pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 mL，置45℃水浴使分散，混匀，静置10 min， 取上清液，作为1∶ 10 供试液。取小蓟炭配方颗粒 10 g， 加 pH 7. 0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至 100 mL，混匀，作为 1∶10供试液。取孟鲁司特钠颗粒10 g，加 pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 mL，混匀，静置10 min，取下层，作为1∶10 供试液。取双氯芬酸钠贴片100 cm2，除去保护层，用无菌纱布覆盖粘贴面，置pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100mL中，用力振荡30min，制成1：10供试液。
2、中国药典 2010 年版微生物限度检查方法
菌液的制备
大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌：取新鲜培养物接种至营养肉汤培养基中，置30～35℃培养18～24 h培养物用0. 9%无菌氯化钠溶液制成每1mL含菌数为50～100 cfu的菌悬液 用于控制菌验证时配制成每1mL含菌数小于100cfu的菌悬液。
白色念珠菌:取新鲜培养物接种至改良马丁培养基中，置23～28℃培养24～48h培养物用0. 9%无菌氯化钠溶液制成每1mL含菌数为 50～100 cfu 的菌悬液。
黑曲霉:取新鲜培养物接种至改良马丁琼脂斜面培养基中，置23～ 28℃培养 5～7d，加入3～5mL含0.05% (v /v) 聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管中，用含0.05% (v /v) 聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每 lmL含孢子数50～100 cfu的孢子悬液。
验证试验
平皿法 分别取1：10 或 1∶100 供试液1，0.5，0. 2，0.1 mL，试验菌液1mL，注入同一平皿中，立即倾注相应琼脂培养基，待凝，在
相应温度培养， 每株试验菌平行制备2个平皿， 测定试验组菌落数， 同法测定菌液组和供试品对照组的菌落数 按公式［各菌株回收率(%) = (试验组的平均菌落数-供试品对照组的平均菌落数) /菌液组的平均菌落数×100%］计算回收率， 结果见表1
薄膜过滤法 取1∶10 供试液1 mL，滤过，冲洗，在最后一次冲洗液中加入试验菌，取膜贴于营养琼脂平板上，培养，测定试验组菌落数， 同法测定菌液组和供试品对照组的菌落数，按上述公式计算回收率， 结果见表1。
控制菌检查 大肠菌群:取1∶10供试液1mL大肠埃希菌菌悬液1mL， 加至10mL的乳糖胆盐发酵培养基中，照大肠菌群的检查法进行验证大肠埃希菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌:各取1∶10 供试液10 mL及相应的菌悬液1mL，加至100mL的相应培养基中，照相应控制菌项下的检查法进行验证，结果见表2
3、中国药典 2015 年版微生物限度检查方法
菌液的制备
大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌:取新鲜培养物接种至胰酪大豆胨液体培养基中，置 30 ～35 ℃培养18～24 h;培养物用0. 9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液用于控制菌验证时配制成每1mL含菌数小于100 cfu 的菌悬液白色念珠菌:取新鲜培养物接种至沙氏葡萄糖液体培养基中，置20～25℃培养2～3d;培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液。
黑曲霉:取新鲜培养物接种至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基中，置20～25℃培养5～7 d，加入3～5mL含0.05% (v /v) 聚山梨酯80 的0. 9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管中，用含0. 05% (v /v) 聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的孢子悬液。
计数方法适用性试验
?需氧菌总数 平皿法:各取1：10 或1∶20或1∶ 50供试液 10 mL于灭菌试管中， 加入相应试验菌 0. 1 mL 使其最终浓度为每1 mL 不大于100 cfu 菌液，混匀，从试管中吸取1mL 注入平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂，待凝，在30～35℃培养，每株试验菌平行制备2个平皿，测定试验组菌落数，同法测定菌液组和
供试品对照组的菌落数按公式［各菌株回收=(试验组的平均菌落数-供试品对照组的平均菌落数/菌液对照组的平均菌落数］计算回收， 结果见表3。
薄膜过滤法:取1∶10 供试液10 mL 于灭菌试管中，加入相应试验菌 0. 1 mL 使其最终浓度为每1 mL不大于100 cfu 菌液，混匀，从试管中吸取1 mL注入100 mL pH 7. 0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，滤过，冲洗，滤干，取膜贴于胰酪大豆胨琼脂平板上，培养， 测定试验组菌落数， 同法测定菌液组和供试品对照组的菌落数 按上述公式计算回收，结果见表3
?霉菌和酵母菌总数 平皿法:各取 1：10供试液10 mL于灭菌试管中，加入相应试验菌 0. 1mL使其最终浓度为每 1 mL 不大于100 cfu 菌液，混匀，从试管中吸取 1 mL 注入平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂，待凝，在 20～25℃培养，每株试验菌平行制备2 个平皿，测定试验组菌落数，同法测定菌液组和供试品对照组的菌落数 按公式【各菌株回收=(试验组的平均菌落数-供试品对照组的平均菌落数/菌液对照组组的平均菌落数】计算回收，结果见表4
?控制菌检查 耐胆盐革兰阴性菌:分别取培养后( 1～2 h)的1∶10 供试液各1 mL，大肠埃希菌菌悬液1 mL 及铜绿假单胞菌菌悬液 1 mL， 分别加至10 mL 的肠道菌增菌液体培养基中，按耐胆盐革兰阴性菌的检查法进行适用性试验。
大肠埃希菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌:各取1∶10供试液 10 mL及相应的菌悬液1 mL，加至100 mL 的胰酪大豆胨液体培养基中， 按相应控制菌项下的检查法进行适用性试验，结果见表5
4、样品检测
取样品， 分别按以上方法制备供试液，依法检查，两种方法检验结果比对见表6 ～ 7
由上述可见，虽然《中国药典》2010年版与《中国药典》2015 年版公示稿的微生物限度检查法回收试验方法不同，但敏感菌是相同的，如灵芝孢子红景天胶囊对金黄色葡萄球菌有抑制作用，两种方法均需要增加稀释液或培养基体积才能消除其抑菌性。因此，中国药典 2015 年版实施时，我们可以在《中国药典》2010年版的方法中找出敏感菌株，先以敏感菌株做预试验，从而减少工作量，提高工作效率。