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血液制品的纯度检测--电泳法

2016/5/18 15:24:42      来宝商城

电泳是指溶解或悬浮于电解液中的带电荷的蛋白质、胶体、大分子或其他粒子,在电流作用下向其自身所带电荷相反的电极方向迁移。

醋酸纤维素薄膜电泳法

醋酸纤维素薄膜电泳法以醋酸纤维素薄膜作为支持介质。介质孔径大,没有分子筛效应,主要凭借被分离物中各组分所带电荷量的差异进行分离,适用于血清蛋白、免疫球蛋白、脂蛋白、糖蛋白、类固醇激素及同工酶等的检测。

1、仪器装置

电泳仪

2、试剂

(1)巴比妥缓冲液( pH8. 6 ) 取巴比妥2.76g、巴比妥钠1 5 .4 5 g ,加水溶解使成1000ml.

(2 )染色液常用的有以下几种,可根据需要,按各品种项下要求使用。

①氨基黑染色液取0.5 g的氨基黑10B,溶于甲醇50ml、冰醋酸10ml及水40ml的混合液中。

②丽春红染色液取丽春红9.04g、三氯醋酸6g,用水溶解并稀释至100mL

③含有醋酸的丽春红染色液取丽春红0.1g,醋酸5ml,用水制成100ml的溶液。4保存。

④含有三氯醋酸和5-磺基水杨酸的丽春红染色液取丽春红2g,三氯醋酸30g5-磺基水杨酸3 0 g ,用水溶解并稀释至100ml

(3 )脱色液取乙醇45ml、冰醋酸5ml及水50ml,混匀。

(4 )透明液取冰醋酸25ml加无水乙醇75ml,混匀。

3 .测定法

(1)醋酸纤维素薄膜   取醋酸纤维素薄膜,裁成2cmX 8cm的膜条,将无光泽面向下,浸入巴比妥缓冲液(pH8.6)中,待完全浸透,取出夹于滤纸中,轻轻吸去多余的缓冲液后,将膜条无光泽面向上,置电泳槽架上,经滤纸桥浸人巴比妥缓冲液(PH8.6 )中。

(2 )点样与电泳  于膜条上距负极端2cm处,条状滴加蛋白质含量约5%的供试品溶液2?3μl,一般应在10?12V/cm稳压或0.4?0. 6mA/cm [总电流量=电流量(mA/cm) X 每条膜的宽度(cm )X 膜条数]稳流条件下电泳至区带距离4?5cm为宜。

人血白蛋白与免疫球蛋白类样品,在测定时取新鲜人血清作对照,电泳时间以白蛋白与免疫球蛋白之间的电泳展开距离约2cm为宜。

(3)染色电泳完毕,将膜条取下浸于氨基黑或丽春红染色液中,2?3分钟后,用脱色液浸洗数次,直至脱去底色为止。

(4)透明将洗净并完全干燥后的膜条浸于透明液中,—般浸泡 10?1 5分钟,待全部浸透后,取出平铺于洁净的玻璃板上,干后即成透明薄膜,可用于相对含量、纯度测定和作标本长期保存。

(5)含量测定未经透明处理的醋酸纤维素薄膜电泳图可按各品种项下规定的方法测定,一般采用洗脱法或扫描法,测定各蛋白质组分的相对含量(%)。洗脱法将洗净的膜条用滤纸吸干,剪下供试品溶液各电泳图谱的电泳区带,分别浸于1.6%的氢氧化钠溶液中,振摇数次,至洗脱完全,照紫外-可见分光光度法,在各品种项下规定的检测波长处测定洗脱液的吸光度。同时剪取与供试品膜条相应的无蛋白质部位,同法操作作为空白对照。先计算吸光度总和,再计算各蛋白质组分所占比率()。扫描法将干燥的醋酸纤维素薄膜用薄层色谱扫描仪采用反射(未透明薄膜)或透射(已透明薄膜)方式在记录器上自动绘 出各蛋白质组分曲线图,横坐标为膜条的长度,纵坐标为吸光度,计算各蛋白质组分的含量(%)。亦可用微机处理积分计算。人血白蛋白与免疫球蛋白类样品,以人血清作为对照, 按峰面积计算各蛋白质组分的含量(%)。

 

标签:电泳仪血液分析      阅读量:637
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