一、WB结果中背景较高
1、膜封闭不够。延长封闭时间，选择更加合适的封闭液。
2、一抗稀释梯度不合适。对抗体进行滴度测试，选择最适宜的抗体稀释梯度。
3、一抗孵育温度偏高。建议4℃孵育过夜。
4、选择的膜容易产生高背景。一般硝酸纤维素膜的背景会比PVDF膜低。
5、检测曝光时间过长，减少曝光时间。
二、WB结果中杂带较多
1、目的蛋白有多个修饰位点（磷酸化位点、糖基话位点，乙酰化位点等），选择和固定位点相结合的一抗，查阅文献或进行生物学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白实际大小。
2、样本处理过程中目的蛋白发生降解。加入蛋白酶抑制剂，样本处理在冰上操作。
3、上样量过高，太敏感。减少上样量。
4、一抗特异性不高或不纯。选择纯化的高特异性一抗，一抗的来源种属不要和样本来源种属一致。
三、WB实验结果无信号或显示信号弱
1、检测样本不表达目的蛋白。选择表达量高的细胞作为阳性对照，或用样本做其他实验（如IHC，ELISA）,用来确定检测样本是否为阴性。
2、检测样本中目的蛋白低，提高上样量。
3、转移不完全或过转移。可以用丽春红染膜并结合染胶（考马斯亮蓝）后确定条带是否转移到膜上或转移过头，适当调节转移时间或电流。
4、抗体不能识别测试种属的蛋白，购买抗体前认真阅读抗体说明书、确定其是否能够交叉识别测试种属对应的蛋白。
5、二抗与一抗来源不匹配。二抗的作用种属与一抗的种属来源应该一致。
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