组成蛋白质的基本单位是氨基酸,氨基酸通过脱水缩合形成肽链,蛋白质是一条或多条多肽链组成的生物大分子。不同品种应针对自身蛋白质特性选择适宜的测定方法并做相应方法学验证,同时应尽可能选用与待测定品种蛋白质结构相同或相近的蛋白质作对照品。
第一法 凯氏定氮法
本法系依据蛋白质为含氮的有机化合物,当与硫酸和硫酸铜、硫酸钾一同加热消化时使蛋白质分解,分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离,用硼酸液吸收后以硫酸滴定液滴定,根据酸的消耗量算出含氮量,再将含氮量乘以换算系数,即为蛋白质的含量。本法灵敏度较低,适用于0.2-2.0mg氮的测定。氮转化成蛋白质的换算系数因蛋白质中所含氨基酸的结构差异会稍有区别。
第二法 福林酚法(Lowry法)
本法系依据蛋白质分子中含有的肽键在碱性溶液中与 Cu2+螯合形成蛋白质-铜复合物,此复合物使酚试剂的磷钼酸还原,产生蓝色化合物,同时在碱性条件下酚试剂易被蛋白质中酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸述原呈蓝色反应。在一定范围内其颜色深浅与蛋白质浓度呈正比,以蛋白质对照品溶液作标准曲线,采用比色法测定供试品中蛋白质的含量。
本法灵敏度高,测定范围为20-250μg。但对本法产生干扰的物质较多,对双缩脲反应产生干扰的离子,同样容易干扰福林酚反应,且影响更大。如还原物质、酚类、枸橼酸、硫酸铵、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。除另有规定外,按方法1 操作;如有干扰物质时,除另有规定外,按方法2 操作并需经方法学验证。
第三法 双缩脲法
本法系依据蛋白质分子中含有的两个以上肽键在碱性溶液中与Cu2+形成紫红色络合物,在一定范围内其颜色深浅与蛋白质浓度呈正比,以蛋白质对照品溶液作标准曲线,采用比色法测定供试品中蛋白质的含量。
本法快速、灵敏度低,测定范围通常可达1-10mg。本法干扰测定的物质主要有硫酸铵、三羟甲基氨基甲烷缓冲液和某些氨基酸等。
第四法 2,2'-联喹啉-4,4'-二羧酸法(BCA法)
本法系依据蛋白质分子在碱性溶液中将Cu2+还原为Cu+, 2,2'联喹啉-4,4'-二羧酸(BCA ) 与Cu+结合形成紫色复合物,在一定范围内其颜色深浅与蛋白质浓度呈正比,以蛋白质对照品溶液作标准曲线,采用比色法测定供试品中蛋白质的含量。
本法灵敏度较高,测定范围可达80-400μg。本法测定的供试品中不能有还原剂和铜螯合物,否则干扰测定。
第五法 考马斯亮蓝法(Bradford法)
本法系依据在酸性溶液中考马斯亮蓝G250与蛋白质分子中的碱性氨基酸(精氨酸)和芳香族氨基酸结合形成蓝色复合物,在一定范围内其颜色深浅与蛋白质浓度呈正比,以蛋白质对照品溶液作标准曲线,采用比色法测定供试品中蛋白质的含量。
本法灵敏度高,通常可测定1-200Mg 的蛋白质量。本法主要的干扰物质有去污剂、Triton X-100、十二烷基硫酸钠(SDS)等,供试品缓冲液呈强碱性时也会影响显色。
第六法 紫外-可见分光光度法
本法系依据蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸,其在280nm波长处具最大吸光度,在一定范围内其吸光度大小与蛋白质浓度呈正比。
本法操作简便快速,适用于纯化蛋白质的检测,一般供试品浓度为0.2-2mg/ml。本法准确度较差,干扰物质多。