一、实验原理
在SSCP测定中,双链DNA(dsDNA)被变性成为单链DNA(ssDNA),每一条单链DNA都基于它们的内部序列而呈现出一种独有的折叠构象,即使同样长度的DNA单链因其碱基顺序不同、甚至单个碱基的不同会形成不同的构象。这些单链DNA在非变性条件下,用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,单链DNA的迁移率和带型,都取决于其折叠构象和电泳时的温度。
SSCP与变性凝胶电泳基本一致,聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤不同之处有以下几点:
a.SSCP使用非变性凝胶进行电泳,即在凝胶配制中不加入变性剂。常用8%非变性胶(丙烯酰胺 80g,N- N,-亚甲双丙烯酰胺 2.76 g,10×TBE 50ml,加水定容到1L)
b.工作环境,由于SSCP受温度影响,所以在电泳过程中应防止温度的升高,所以电泳环境为电压400V,电流50mA,单板电泳功率为9W,不用预热。缓冲液最好用新配制的。
c.由于电泳功率较低,所以电泳时间较长,通常需要10小时以上,因此一般电泳需要过夜。室温在25℃以下。
聚丙烯酰胺凝胶电泳适宜分离鉴定低分子量的蛋白质,小于1kb的DNA片段和DNA序列。
试剂准备
30%丙烯酰胺:丙烯酰胺29g,N-N,-亚甲双丙酰胺 1g。加水至100ml,40C棕色瓶可保存2个月
5*TEB缓冲液:TRIS碱 54g 硼酸 27.5g EDTA 3.72g 加水至1L。
凝胶浓度(%) | 30%聚丙烯酰胺 ml | 水(ml) | 5*TBE(ml) | 10%过硫酸铵(ml) | 有效分离范围(bp) | 二甲苯氰FF(ul) | 溴酚蓝(ul) |
3.5 | 11.6 | 67.7 | 20 | 0.7 | 1000-2000 | 460 | 100 |
5 | 16.6 | 62.7 | 20 | 0.7 | 80-500 | 260 | 65 |
8 | 26.6 | 52.7 | 20 | 0.7 | 60-400 | 160 | 45 |
12 | 40 | 39.3 | 20 | 0.7 | 40-200 | 70 | 20 |
20 | 66.6 | 12.7 | 20 | 0.7 | 25-150 | 60 | 15 |
二、跑胶步骤
从NaOH池中捞出浸泡的玻璃板,取出上面的残胶
2.2 把玻璃板拿到流动水处洗刷干净
2.3 洗干净的玻璃板至于玻璃板架上晾干
2.4 用乙醇擦洗玻璃板
2.5 带凹口的背板涂上硅化剂,面板则涂上粘合剂,防止电泳完毕发生撕胶和脱胶的可能(涂摸要均匀)
2.6 面板在下,背板在上。两侧用塑料板密封,并用夹子夹好。底部调节使之水平
2.7 将加入催化剂后的凝胶沿凹口均匀倒下,插入适当的封条。勿使封条下留下气泡。用夹子夹紧封条部位
2.8 室温聚合30分钟,小心取出凹口处封条,用水冲洗加样孔(否则封条所残留的丙烯酰胺在加样孔聚合产生不规则表面,引起DNA带变形)
2.9 将凝胶固定在电泳槽里。带凹口背板朝里,面向缓冲液槽
2.10 用0. 5×TBE灌满电泳槽的缓冲液槽,接上电极,打开电源。调试工作环境为电压2000-2200V,电流150-200mA,单板电泳功率为80W。预热30分钟左右。
2.11 点样之前需切断电源,用枪将点样孔的气泡及胶吹出,然后插入点样梳,注意不要插得太深,否则点样胶面会变形,影响美观及点样。
2.12枪吸加样品,PCR产物先加loading buffer 10ul ,再变性5分钟左右,接着在冰水中冷却5分钟以上方可点样,点样完毕,电泳开始。
2.13 电泳至所需位置后,切断电源,拔出导线,回收缓冲液,卸下玻璃板。在工作台上,将背板撬起,放回原处。将面板进行银染
3. 电泳后的银染检测
3.1 原理:
影像产生是由于核酸在胶上所占部位与周围的氧化——还原势不同而产生。银染液中的银离子(Ag+)可与核酸形成稳定的复合物,然后用还原剂如甲醛使Ag+还原成银颗粒,这样核酸电泳带就染成了黑褐色。
3.2 银染
银染液的配制:称2.5至3.0g AgNO3加1200---1400ml水
银染:将电泳完的面板首先在银染漂洗盆了漂洗赶紧,使胶面上没有异物。玻璃板反面没有污染物。
将加入银染液的银染盆放在摇床上后,将面板放入银染1小时左右。
3.3 显影
显影液的配制:NaOH---20g, Na2CO3----0.6g,甲醛4.5ml,加水1200ml
显影:将面板从银染盆里取出,在银染漂洗盆里漂洗,震荡5-6次,取出后使其表面尽量无水,再放入已加入显影液的显影盆里(显影,显影液的配制及甲醛的加入都需要在通风橱的摇床上进行)显影过程大约10到15分钟,以DNA条带清晰可见为准。
将显现完毕的板子在显影漂洗盆里漂洗后,方可读带。
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