1、取材及固定
切取的小块组织先用0.85%的生理盐水漂洗以洗去血液与污渍,如果是管状组织则必须把管腔中污物洗净。材料由取下后应当迅速固定,固定的目的是尽快使固定液渗入组织内部,将组织固定以保持其原有的结构。不同的组织应选用适当的固定液。固定液的用量与组织块体积之比一般在20:1。
2、冲洗
固定后的组织块在进行脱水前必须用流水洗去固定液。组织块应用纱布包好,注明放金属水洗网中用流水冲洗,甲醛固定液固定的组织一般水洗24小时Bouins固定液固定的组织水洗24小时。AFA固定液则不需要水洗。
3、脱水和硬化
经固定后的组织在水洗后进行脱水,目的是将组织内的水分用酒精或其他溶剂置换出来,使组织变硬,便于油类或其他透明剂浸入。可以用自动脱水机对组织进行脱水,也可以采用不同浓度的酒精。酒精脱水要逐级上升,跳级脱水会引起组织块强烈的收缩变形。脱水所用的酒精浓度及过程如下:
30%-50%-70%-80%-90%-95%-100%
4、透明
透明是石蜡切片法切片前必经的一步。其目的在于用矿物油或植物油等透明剂置换出无水酒精,以便于熔化的石蜡浸渗到组织间隙中故透明剂必须是能分别与石蜡和酒精相溶的。经过透明剂处理的组织块用肉眼对光观察呈透明现象,所以这个过程称为透明。
常用的透明剂有二甲苯、苯、甲苯等.这些都是穿透力强易使组织变脆的透明剂因此透明的时间宜短,一般在20分钟即可。
5、浸渗
浸渗过程是使包埋组织用的物质深入到所有的组织间隙中然后再通过各种方法使这种物质凝固,而将组织材料包埋其中石蜡切片法和火棉胶切片法都需要浸渗过程。石蜡切片法是将加热的石蜡渗到组织中而火棉胶切片法是使火棉胶渗到组织间隙中去。在浸渗前要先将选好的石蜡分别以容器装好放在恒温箱中,使其杂质沉淀。石蜡最好选用软蜡和硬蜡两种,软蜡熔点为45-50℃之间,硬蜡熔点为56-58℃之间,60-62℃的硬蜡很少用。
组织块在各个蜡杯中浸蜡的时间如下
蜡的总时间一般为:0.5立方厘米的组织块时间为6-8小时,0.2-0.3立方厘米的组织块时间为3-5小时,0.1-0.2立方厘米的组织块时间为2-3小时。当发现蜡杯中有灰尘或组织碎块时应使其沉淀或过滤后再使用。浸蜡不透包埋后会出现白色不透明部分,此时需要再浸蜡一次。
6、包埋
包埋就是将已经浸渗好的组织块包埋于浸渗剂中,石蜡包埋法如下:
浸蜡终了时,将预先预热好的和第四杯石蜡相同熔点的石蜡倒入折好的蜡槽内,然后从第四个蜡杯中取出组织块,放入蜡槽内摆好位置,注意组织切面的摆放方向。放好组织后可以自然冷却,也可以放入冷水中直接冷却。
7、塑型和切片
将蜡块固定在切片机上,调好距离和所要求的切片厚度,然后用右手摇动手柄,即可进行切片了。一般来讲生物切片的厚度在5-10微米。
对于切下的切片不要用手去取,因为体温可以使蜡片粘到手上,正确的做法是用毛笔或牙签挑取,然后放在载玻片上进行展片和粘片。
8、展片和粘片
切下的组织蜡片往往带有皱褶,所以在染色前必须进行蜡片的展片和粘片,即把切好的蜡片平整的粘在载玻片上。展片的温度因石蜡熔点的不同而的不同,一般的56-58℃的石蜡切片37℃的温水进行展片,48-52℃的石蜡切片用35℃的温水进行展片。等到蜡片充分展平后,取一清洁载玻片,载玻片上涂一薄层蛋白甘油,然后在水中捞取蜡片,捞完后将蜡片摆正,放到格盘内,置38℃温箱中烘干,然后即可进行染色。
9、染色和封固
为了观察组织内部的细微结构,必须应用某些与固定后的原生质有亲合性的染料对组织进行染色,否则有碍观察。普通的染色法有两种即苏木紫伊红染色法,染色结果是细胞核为紫色,细胞质为粉红色。另一种方法为铁苏木紫染色染色的结果是全部着以深浅不同的蓝色。
苏木紫伊红染色法整个染色过程如下:
取已经干燥的切片,放于盛有二甲苯的染缸内脱蜡10min左右这个过程称为脱蜡。脱完蜡后的切片即可进行染色。
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