莱克多巴胺与盐酸克伦特罗(俗称瘦肉精)一样,均属于β-肾上腺素兴奋剂,用在养殖业,主要是为了使猪和牛加快生长并提高瘦肉率。大量食用含有莱克多巴胺残留的肉类或内脏时,可能引发中毒症状,如呼吸困难、恶心、呕吐、头晕、头痛、肌肉震颤、心悸、心律失常、血压上升、促进心血管疾病,影响生殖系统,等等。在我国境内禁止生产和销售莱克多巴胺。
一、实验原理:
采用间接竞争ELISA方法,在微孔条上包被偶联抗原,试样中残留的莱克多巴胺药物与酶标板上的偶联抗原竞争莱克多巴胺抗体,加酶标记的抗体后,显色剂显色,终止液终止反应。用酶标仪在450nm处测定吸光度,吸光值与莱克多巴胺残留量成负相关,与标准曲线比较即可得出莱克多巴胺残留含量。
二、仪器和设备
天平:精度0.01g。
组织匀浆机。
离心机:不低于4000r/min,配10mL、50mL离心管。
氮吹仪。
微型振荡器。
移液器(单道20uL,50uL,100uL,1000uL;多道250uL)
酶标仪:配450nm滤光片。
莱克多巴胺检测试剂盒。
三、实验流程:
1、样品前处理
称取试样3g±0.03g于50mL离心管中,加乙腈9mL,振荡10min,4000r/min离心10min;取上清液4mL于10mL离心管中,50℃水浴下氮气吹干;加正己烷1 mL,涡动30s;再加缓冲工作液1 mL,涡动1 min,4000r/min离心5 min,肌肉组织取下层液100 uL与样本缓冲工作液100 uL混合;肝组织取下层液50 uL与样本缓冲工作液150 uL混合,各取50 uL分析。肌肉组织的稀释倍数为1.5倍,肝组织的稀释倍数为3倍。
2、测定
使用时将试剂盒在室温下静置1h~2h。
按每个标准溶液和试样溶液至少两个平行计算,将所需数目的酶标板条插入板架中。
加标准品或样本50uL/孔后,每孔再加莱克多巴胺抗体工作液50uL,轻轻振荡混匀。用盖板膜盖板,置室温下反应30min。
倒出孔中液体,将酶标板倒置在吸水纸上拍干,以保证完全除去孔中的液体,加250uL洗涤工作液至每个孔中,5S再倒掉孔中的液体,将酶标板倒置在吸水纸上拍打,以保证完全除去孔中的液体。再加250uL洗涤工作液,重复操作两遍以上(或用洗板机洗涤)。
加酶标记物100uL每孔。用盖板膜盖板后置室温下反应30min,取出重复洗板步骤。
加底物液A液和B液各50uL每孔,轻轻振荡混匀于室温下避光显色15min~30min。
加终止液50uL每孔,轻轻振荡混匀,置酶标仪于450nm波长处测量吸光度值。
结果判定和表述
用所获得标准溶液和试样溶液吸光度值的比值进行计算。见式(1)。
式中:
B—标准(试样)溶液的吸光度值。
B0—空白(浓度为0标准溶液)的吸光度值。
将计算的相对吸光度值(%)对应莱克多巴胺标准品浓度(ug/L)的自然对数作半对数坐标系统曲线图,对应的试样浓度可从校正曲线得出。
方法筛选结果为阳性的样品,需要用确证方法确证。