1.1 检测HBsAg
ELISA双抗体夹心法操作步骤:
a)配液:将3OmL浓缩洗涤液(20 X)用蒸馏水或去离子水稀释至600mL备用。
b)编号:将样品对应微孔按序编号,每板应设阴、阳性对照各2孔和空白对照1孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂,其余各步相同)。
c)加样:分别在相应孔中加人待测样品或阴、阳性对照50ul。
d)温育:用封板膜封板后置37℃温育60mmn,
e)洗涤:吸去板内液体,用洗涤液注满各孔,静置1mm后吸干,重复洗涤5次,拍干。
f)加酶:每孔加人酶标试剂1滴(501L),轻轻振荡混匀。
g)温育:用封板膜封板后置37C温育60mm,
h)洗涤:将孔内液体吸干,用洗涤液充分洗涤5次,拍干。
i)显色:每孔加人显色剂A.B液各1滴(50uL),轻轻振荡混匀,37C避光显色15min,
j)测定:每孔加人终止液1滴(50uL),轻轻振荡混匀,设定酶标仪波长于450nm处(建议用双波长
450/630nm检测),用空白孔调零点后测定各孔OD值。
结果判断:
a)临界值(CUTOFF)计算:临界值=阴性对照孔OD均值X2.1(阴性对照孔OD值低于0.05
者按0.05计算)
b)阳性判定:样品OD值≥临界值(CUTOFF)者判阳性。
c)阴性判定:样品OD值<临界值(CUTOFF)者判阴性。
1.2 检测抗-HBs
ELISA双抗原夹心法操作步骤:
a)配液:将3OmL浓缩洗涤液(20 X)用蒸馏水或去离子水稀释至600mL备用。
b)编号:将样品对应微孔按序编号,每板应设阴、阳性对照各2孔和空白对照1孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂,其余各步相同)。
c)加样:分别在相应孔中加人待测样品或阴、阳性对照50ul.
d)温育:用封板膜封板后置37C温育60min,
e)洗涤:吸去板内液体,用洗涤液注满各孔,静置1min后吸干,重复洗涤5次,拍干。
f)加酶:每孔加人酶标试剂1滴(50uL),轻轻振荡混匀。
g)温育:用封板膜封板后置37C温育60min,
h)洗涤:将孔内液体吸干,用洗涤液充分洗涤5次,拍干。
i)显色:每孔加人显色剂A、B液各1滴(50ul),轻轻振荡混匀,37℃避光显色15min,
j)测定:每孔加人终止液1滴(50uL),轻轻振荡混匀,设定酶标仪波长于450nm处(建议用双波长450/630nm检测),用空白孔调零点后测定各孔OD值。
结果判断:
a)临界值(CUTOFF)计算:临界值=阴性对照孔OD均值X2.1(阴性对照孔OD值低于0.05
者按0.05计算)
b)阳性判定:样品OD值≥临界值(CUTOFF)者判阳性。
c)阴性判定:样品OD值<临界值(CUTOFF)者判阴性。
1.3 检测HBeAg
ELISA双抗体夹心法操作步骤:
a)配液:将3OmL浓缩洗涤液(20X)用蒸馏水或去离子水稀释至600mL备用。
b)编号:将样品对应微孔按序编号,每板应设阴、阳性对照各2孔和空白对照1孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂,其余各步相同)。
c)加样:分别在相应孔中加人待测样品或阴、阳性对照50ul
d)温育:用封板膜封板后置37℃温育60min
e)洗涤:吸去板内液体,用洗涤液注满各孔,静置1min后吸干,重复洗涤5次,拍干。
f)加酶:每孔加人酶标试剂1滴(501L),轻轻振荡混匀。
g)温育:用封板膜封板后置37℃温育60min.
h)洗涤:将孔内液体吸干,用洗涤液充分洗涤5次,拍干。
i)显色:每孔加入显色剂A、B液各1滴(50ul),轻轻振荡混匀,37C避光显色15min
j)测定:每孔加人终止液1滴(5如L),轻轻振荡混匀,设定酶标仪波长于450nm处(建议用双波长450/630nm检测),用空白孔调零点后测定各孔OD值。
结果判断:
a)临界值(CUTOFF)计算:临界值=阴性对照孔OD均值X2.1(阴性对照孔OD值低于0.05
者按0.05计算)
b)阳性判定:样品OD值≥临界值(CUTOFF)者判阳性。
c)阴性判定:样品OD值<临界值(CUTOFF)者判阴性。
1.4 检测抗一HBe
ELISA竞争抑制法检测步骤:
a)配液:将3OmL浓缩洗涤液(20X)用蒸馏水或去离子水稀释至600mL备用。
b)编号:将样品对应微孔按序编号,每板应设阴、阳性对照各2孔和空白对照1孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂,其余各步相同)。
c)加样:分别在相应孔中加人待测样品或阴、阳性对照50ul
d)加酶:每孔加人酶标试剂1滴(50ul),轻轻振荡混匀。
e)温育:用封板膜封板后置37C温育60min
f)洗涤:将孔内液体吸干,用洗涤液注满各孔,静置1min后吸干,重复洗涤5次,拍干。
g)显色:每孔加人显色剂A、B液各1滴(50拌L),轻轻振荡混匀,37C避光显色15min
h)测定:每孔加人终止液1滴(50拼L),轻轻振荡混匀,设定酶标仪波长于450nm处(建议用双波长450/630~检测),用空白孔调零点后测定各孔OD值。
结果判断:
a)临界值(CUTOFF)计算:临界值=阴性对照孔OD均值X0.50
b)阳性判定:样品OD值≤临界值(CUTOFF)者判阳性。
c)阴性判定:样品OD值>临界值(CUTOFF)者判阴性。
A.1.5 检测抗一HBc
ELISA竟争抑制法检测步骤:
a)配液:将3OmL浓缩洗涤液(20X)用蒸馏水或去离子水稀释至600mL备用。
b)编号:将样品对应微孔按序编号,每板应设阴、阳性对照各2孔和空白对照1孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂,其余各步相同)。
c)加样:分别在相应孔中加人待测样品或阴、阳性对照50ul
d)加酶:每孔加入酶标试剂1滴(5Oul),轻轻振荡混匀。
e)温育:用封板膜封板后置37℃温育60min
f)洗涤:将孔内液体吸干,用洗涤液注满各孔,静置1mm后吸干,重复洗涤5次,拍干。
g)显色:每孔加人显色剂A、B液各1滴(50ul),轻轻振荡混匀,37C避光显色15min,
h)测定:每孔加入终止液1滴(5OuL),轻轻振荡混匀,设定酶标仪波长于450nm处(建议用双波长450nm/630nm检测),用空白孔调零点后测定各孔OD值。
结果判断:
a)临界值(CUTOFF)计算:临界值=阴性对照孔OD均值X0.50
b)阳性判定:样品OD值≤临界值(CUTOFF)者判阳性。
c)阴性判定:样品OD值>临界值(CUTOFF)者判阴性。
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