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巨细胞病毒PCR检测

2016/8/20 12:01:13      来宝商城

巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)感染目前已日益受到重视;因受染细胞呈巨细胞化,胞质、胞核内可见包涵体,故又名巨细胞包涵体病(cytomegalic inclusion disease,CID)。受染后病毒可局限于涎腺,有的则导致全身性感染。CMV感染大多呈亚临床型,显性感染者则有多样化的临床表现,严重者可致死。由于巨细胞病毒可经宫内感染造成死胎、流产、早产,也可导致先天畸形。

PCR模板的制备:随机留取160份产前检查孕妇自凝血3ml,4℃ 2000r/min离心15min,取400ul血清加至装有40ulSTE的1.5ml微量离心管中,100℃水浴10min,13000r/min离心10min,取上清置于-20℃备用。阳性室对照模板为HCMV AD169 DNA。

PCR反应体系:反应体系中1/10体积的10×PCR反应缓冲液,模板4ul,阳性对照模板2ul,镁离子、dNTP、Taq酶、引物、二甲基亚砜浓度及循环参数经优化后确定。套式PCR是先用一对外侧引物进行第一次扩增,然后将2ul扩增产物用内侧引物进行第一次扩增,用2ul扩增产物进行第二次扩增。双重PCR是在同一反应体系中加入LA基因和IE基因的两对特异性引物,一次扩增两个DNA片段。

凝胶电泳 用20g/l的琼脂糖凝胶对扩增产物和Marker共同电泳,在紫外线透射仪上观察结果照相。

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