1、组织提取和处理
1)手术切除的标本立即置于冰壶中存放着的RPMI1640中,随后立即送往实验室。
2)将标本取出置于无菌的平皿中,使用无菌手术刀取出周边坏死组织和脂肪组织。
3)用D-Hanks溶液清洗3遍去除血迹。
4)将组织置于双抗溶液(青霉素5×105U/L,链霉素100mg/L)中,浸泡20min。
2、制备单层细胞
1)将组织切成1mm3的组织块,一组置于30ml胶原酶I(2×105U/L)的三角瓶中,封口;一组置于30ml胰蛋白酶的三角瓶中,封口。
2)消化:在37℃空气震荡箱中,120r/min消化(胶原酶I需3h,胰蛋白酶30min)。
3)100目细胞筛过滤,滤液1000r/min离心10min,弃上清。
4)用D-Hanks溶液清洗2遍。
5)5%小牛血清RPMI1640培养基,重悬。
6)细胞计数,109个/L 浓度接种于25ml培养瓶中培养。
其他同常规培养
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