同工酶分析法鉴定ST细胞系的研究

【出处：中国兽药杂志2015，49（12）：6-9/张敏，等】

同工酶是具有同一催化作用， 但组成、 结构及理化性质不同的一组酶，广泛地存在于高等生物细胞内。同工酶是基因编码的产物， 能较好地反映物种间的遗传差异， 常被用于物种的分类、 鉴定和亲缘关系研究 。不同种属来源的细胞具有不同的
同工酶分布，通过电泳分离可得到它们特异性的同工酶图谱， 因此同工酶检测可作为种属鉴别的依据。20世纪60年代，人们即开始将同工酶分析法用于动物细胞种属的鉴别 ， 由于当时只选用1-2种同工酶，这些同工酶图谱在某些种属关系亲近的动物细胞之间差异小，不好区分， 而且细胞种属鉴定一直未引起人们足够的重视， 使此方法未能广泛被采用。后经反复比较求证， 证实在动物细胞鉴定上，选用乳酸脱氢酶LD、 葡萄糖 6 磷酸脱氢酶G6PD 和核苷酸磷酸脱氢酶NP 这三种同工酶即可将动物细胞完全鉴定区分开。

ST 细胞系是猪瘟病毒等猪源病毒的敏感细胞， 常用于猪源病毒的分离培养和体外增殖，近年来被用作猪瘟等疫苗的生产基质发挥了重要作用，其株系特征及纯净性越来越受到人们的重视， 但用同工酶分析法鉴定 ST 细胞的种属及纯净性还未见报道。本文选用乳酸脱氢酶、 葡萄糖 － 6 － 磷酸脱氢酶和核苷酸磷酸脱氢酶三种同工酶， 在借鉴其他细胞同工酶分析方法的基础上， 摸索实验条件， 对CVCC 细胞库保存的 ST 细胞系进行了同工酶分析。
鉴定研究。
1 材料与方法
1． 1 材料
1．1．1 细胞 标准参考细胞株: 猪睾丸原代细胞，从 1 日龄健康仔猪体内分离猪睾丸原代细胞培养，本实验室自制; 内参对照细胞株: 小鼠成纤维细胞系( L929) 、 人宫颈癌细胞系( Hela) ， 均购自美国典型培养物保藏中心( ATCC) ; 样品细胞: 传代猪睾丸ST 细胞系，国家兽医微生物菌种保藏中心( CVCC)细胞库保存。
1．1．2 溶液 细胞裂解液: Tris 0．303 g EDTA0．0186 g，质量分数 2% TritonX － 100 50μL，加水定容至 50 mL，HCl 调pH至 7.5，4 ℃ 保存。巴比妥缓冲液: 巴比妥钠 10.3 g，巴比妥 1.84 g，加水定容至1000 mL，4 ℃ 保存。LD 显色底物: NAD 5 mg， MTT2 mg，PMS 0.4 mg，1 mol /L 乳酸钠 1 mL，0．1 mol /LNaCl 0.5 mL，05 mol /L 的 Tris－Cl ( pH8．0 )1．5 mL， 加水定容至 10 mL。 G6PD 显 色 底 物:NADP 3 mg，MTT 2 mg， PMS 0．4 mg，G6PD 50 mg，MgCl210 mg，0．5 mol /L 的 Tris － Cl( pH 8．0) 2 mL，加水定容至 10 mL。NP 显色底物: 肌苷 20 mg，MTT2 mg， PMS 0．4 mg， 黄嘌呤氧化酶 0．3 unit，0．1 mol /L Na2HPO4 1 mL， 0． 5 mol /L Tris－HCl( pH7． 5) 1 mL，加水定容至 10 mL。琼脂糖凝胶: 琼脂糖0．8 g，EDTA 0．035 g，巴比妥缓冲液 100 mL 加热溶化。
1． 2 方法
1． 2． 1 细胞同工酶的提取［ 6］ 将猪肾原代细胞、L929、 Hela、 ST 细胞系在 T － 25 培养瓶中培养，当生长至铺满瓶底时， 吸出培养基。PBS 洗细胞单层，加1 mL 胰 酶置 37℃ 温箱消化，待细胞脱壁， 加2 mL含 10% 小牛血清的 MEM 培养基中和胰酶的作用，并将其转移至无菌离心管，1000 r /min， 离心10 min，弃去上清，加 1 mL PBS 液吹打均匀，快速离心，吸干残留 PBS。估算细胞的体积，加等体积的细胞裂解液置室温反应 2～3 min，冰上反应30 min，4 ℃ 12000 r /min 离心 5 min，吸出上清移至新的 EP 管， － 20 ℃ 保存。
1． 2． 2 琼脂糖凝胶制备 根据李岑的方法， 将2 片0． 175 mm 厚的市售透明胶片夹在两块胶槽中间，用文件夹将胶槽和胶片固定在一起。将琼脂糖凝胶用注射器缓缓从胶槽上的小孔注入胶槽与胶片之间， 注入凝胶时注意避免气泡的产生， 并使凝胶均匀的分布在胶片上， 待凝固后放 4 ℃ 预冷后使用。
1． 2． 3 电泳 小心将凝胶剥离胶板， 将载有凝胶的胶片放入电泳槽内，然后将细胞裂解上清液用移液枪加到点样孔中， 每孔上样 1 ～ 3 μL， 静置 30 s使样品完全被凝胶吸收后， 注入电泳液， LD 电泳电压为 95 V， 电泳时间为 1． 5 h， G6PD 电泳电压为90 V，电泳时间为 1 h，NP 电泳电压为 85 V，电泳时间为 1 h。为保证同工酶的活性， 电泳过程均在冰浴上进行。
1． 2． 4 显色 停止电泳后， 取出凝胶胶片， 放置在暗盒内，注入 3 ～ 5 mL 对应底物的显色液，37 ℃ 反应 20 ～ 25 min， 酶谱出现后， 在清水中清洗胶片2 ～ 3 次，用滤纸吸去胶片上的残留水分即可拍照。
1． 2． 5 结果判定 显色后，内参细胞 Hela 和 L929同工酶谱带与已发表文献一致， 说明电泳条件成立。样品细胞与标准参考细胞三种同工酶条带数目均相同，且每一条带中心位置与上样孔距离( 迁移距离) 相同， 说明为同一种属细胞， 若无其他杂
带，说明细胞无交叉污染。
2 结 果
2． 1 乳酸脱氢酶( LD) 同工酶电泳试验 结果如图 1 所示。可以看出， Hela 细胞的 LD 同工酶谱条带数有 5 条， 第一条谱带在孔的下方， 其他四条在孔的上方， L929 谱带有 3 条， 均在孔上方， 这与文献［ 6］ 一致，说明电泳条件成立。ST 细胞系、 猪睾丸原代细胞的 LD 同工酶谱条带数也为 5 条， 从迁移距离上看， ST 细胞系和猪睾丸原代细胞的 5 条谱带均在孔的上方， 迁移距离完全一致， 且不存在别的杂带。

2． 2 葡萄糖－6－磷酸脱氢酶( G6PD) 同工酶电泳试验 结果如图 2 所示。可以看出， 四种细胞的G6PD 同工酶谱条带数均为一条， 但迁移距离却存在明显区别， ST 细胞系谱带的迁移距离与猪睾丸原代细胞的距离一致，且不存在别的杂带。

2． 3 核苷酸磷酸脱氢酶( NP) 同工酶电泳试验结果如图 3 所示。可以看出， 四种细胞的 NP 同工酶谱条带数均为一条， 但迁移距离却存在明显区别， ST 细胞系谱带的迁移距离与猪睾丸原代细胞的距离一致，且不存在别的杂带。上述三项试验结果表明， ST 细胞系与猪睾丸原代细胞的三种同工酶谱带完全相同， 且条带中不存在别的杂带，而与 Hela 细胞和 L929 细胞的谱带存在显著差异。因此， 该 ST 细胞系应与猪睾丸原代细胞同种，且不存在其他细胞的交叉污染。
3 讨论与小结
作为生物学研究与生产的重要原材料， 细胞系的株系特性、 种属来源、 是否交叉污染等， 不仅直接
1．Hela 细胞; 2．L929 细胞; 3． 猪睾丸原代细胞; 4．ST 细胞系图 3 NP 同工酶电泳图影响到科研数据的可靠性和真实性， 更关系到生产产品的质量。据分析，每年约有 15% ～ 25% 的研究论文因为使用了被错误辨识和交叉污染的细胞而获得错误的结论，由此导致数以百万美元研究经费的浪费。《欧洲药典》 ［ 8］ 和《中国药典》 ［ 9］ ( 2010 年
版) 中已经规定细胞鉴别试验是必须进行的一项检验，而我国兽用生物制品行业对细胞系的纯净性鉴定尚未引起足够重视。目前国际上对动物细胞系
身份识别、 交叉污染的主要检测方法之一是同工酶检测法，该方法灵敏度较高、 结果可靠、 时间短， 而且只需很少的样品量即可检测。同工酶谱目前还没有商品化的分子 Marker， 因此在实验过程中，我们需要找到一种同源标准细胞株， 既可以选用种属背景清楚的商品细胞株， 也可直接选用原代细胞株。本文选用与 ST 细胞同源的猪原代睾丸细胞作为标准参考细胞株， 同时用 Hela细胞和 L929 细胞作为内参对照细胞。由于同工酶试验受酶含量、 酶活性、 电流、 电压、 电泳时间、 试剂批次、 染色的时间影响很大， 经常不同批次的试剂就需要重新摸索试验条件， 因此前期试验条件的摸索需要耗费较长时间。本试验对提取同工酶的细胞量进行了反复试验， 细胞数太少，所提酶含量就低，电泳显色后， 色带颜色太浅或无色带，无法进行结果判断， 反之， 酶的量太高， 色带太宽或形成空泡样， 影响结果的判断。经摸索，LD 和 NP 同工酶细胞数量在 106 ～ 107 /mL 左右时，实验 结 果 最 佳; 而 G6PD 同 工 酶 细 胞 数 需 达 到109 /mL才能看见明显条带， 这与陈丽婷、 姜典才［ 10］ 的结果相同。其次， 本试验对电泳时间和电压进行了摸索， 电泳时间过短或电压过低， 条带分离不完全， 电泳时间过长或电压过高， 色带过于分散，而且产热多也易使不稳定的同工酶失活造成没有显带。我们采用在冰浴中电泳， 从而降低电泳过程中温度，保护了同工酶的活性。本研究利用三种同工酶成功地对 CVCC 细胞库ST 细胞系进行了种属及交叉污染鉴定，可以为其他动物源细胞的种属鉴定和交叉污染检测提供借鉴。相信随着人们对细胞种属及交叉污染鉴定的日益重视，同工酶分析法将发挥越来越重要的作用。