什么是紫外可见分光光度计光度准确度？
光度准确度( Photometric Accur acy ) 是一个非常重要的技术指标。任何使用者买一台紫外可见分光光度计都是为了分析工作, 进行分析工作的目的是出数据, 其基本要求是数据要准确可靠, 这在很大程度上取决于仪器的光度准确度这个最重要的技术指标及其有关指标。
一、光度准确度的表示方法
目前, 国际上对紫外可见分光光度计光度准确度的表示方法主要有两种:一种是吸光度准确度( Absorbance Accuracy ) 或吸光度误差( Absorbance Er ror ) , 用AA (或ΔA) 表示; 另一种是透射比准确度( Transmittance Accuracy) 或透射比误差, 用TA ( 或ΔT) 表示。国外的紫外可见分光光度计制造商, 绝大多数都给出吸光度准确度或吸光度误差AA ( 或ΔA) , 并都指出在什么吸光度情况下测量。如美国Varian 公司的Cary500、美国P-E 公司的Lambda9、Lambda900 等仪器, 都给出在1. 0Ab s 时, 吸光度准确度或吸光度误差AA (或ΔA) 为±0. 003Ab s。但国外有少数仪器制造商在给出吸光度准确度或吸光度误差AA ( 或ΔA) 的同时, 还给出透射比准确度或透射比误差TA(或ΔT)。如日本岛津公司的UV-260、UV-2450PC、UV-2550PC 等仪器, 都给出在吸光度为0～0. 5A 时, 吸光度准确度或吸光度误差AA ( 或ΔA) 为±0. 002A; 吸光度为0. 5 ～ 1. 0A 时, 吸光度准确度或吸光度误差AA ( 或ΔA) 为±0. 004A。但同时又给出透射比准确度或透射比误差TA (或ΔT) 为±0. 3% T。我国生产紫外可见分光光度计的厂商, 很多都在给出吸光度准确度或吸光度误差AA ( 或ΔA) 的同时, 也给出透射比准确度或透射比误差TA(或ΔT)。如北京普析通用公司的TU-1901、T U-1800 系列, 北京瑞利公司的UV-2100 , 上海分析仪器总厂的760MC 等紫外可见分光光度计等, 在给出吸光度为0～0. 5A 时, 吸光度准确度或吸光度误差AA (或ΔA) 为±0. 002A;吸光度为0. 5 ～ 1. 0A 时, 吸光度准确度或吸光度误差AA ( 或ΔA ) 为±0. 004A。但同时又给出透射比准确度或透射比误差TA (或ΔT) 为±0. 3%T。还有许多制造商只给出透射比准确度或透射比误差TA (或ΔT) , 并且不讲明在多少透射比情况下测试, 这是不对的。我们认为, 给出吸光度准确度或吸光度误差AA (或ΔA) , 同时也给出透射比准确度或透射比误差TA (或ΔT) 是对的。只给出吸光度准确度或吸光度误差AA (或ΔA) , 不给出透射比准确度或透射比误差TA ( 或ΔT) 也是可以的, 因为符合使用者只要求或只使用吸光度表示分析测试结果的习惯。只给透射比准确度或透射比误差TA (或ΔT) ,
而不给吸光度准确度或吸光度误差AA (或ΔA) 是不合适的, 原因如下: 第一,若给出TA (或ΔT) = ±0. 5%T, 而不讲明在什么透射比情况下测试, 就应理解为在0～100%T 范围内的任何地方测试都能达到TA (或ΔT) = ±0. 5% T。但实际上, 若在10% T 处测量, TA ( 或ΔT) = ±0. 5% T 时产生的透射比相对
误差为±5%。而在90%T 处测量, 则TA (或ΔT) = ±0. 5% T 时产生的透射比相对误差为±0. 56% , 二者相差很大。也就是说, 不可能在0～100%T 范围内的任何地方测试都能达到TA (或ΔT) = ±0. 5% T。第二, 用户在使用紫外可见分光光度计时, 基本上没有人只用透射比T 和透射比误差T A ( 或ΔT)来表示光度准确度和分析测试误差。相反, 大家一般都用吸光度值A 和吸光度误差AA (或ΔA) 来表示分析测试结果和分析误差。第三, 为了与国际接轨, 应采用吸光度值A 和吸光度误差AA (或ΔA) 来表示紫外可见分光光度计的光度准确度。因为, 目前国际上绝大多数使用者, 都是采用吸光度值A和吸光度误差AA (或ΔA) 来表示紫外可见分光光度计的分析测试结果和分析误差。第四, 吸光度准确度或吸光度误差AA (或ΔA) 和透射比准确度或透射比误差TA ( 或ΔT) , 在使用时二者在数值上会相差很大。若要把TA(或ΔT) = ±0. 5% T 换算成AA ( 或ΔA) , 则在10% T 处( 相当在1A 处) ,±0. 5% T 的透射比误差, 产生的AA ( 或ΔA ) 为±0. 022A, 而在90% T 处(相当在0. 0046A 处) , TA ( 或ΔT) = ± 0. 5% T 时产生的AA ( 或ΔA) 为±0. 0024A, 这同样是一个惊人的差距。因此, 在给出一台紫外可见分光光度计的光度准确度时, 不管是用吸光度准确度或吸光度误差AA ( 或ΔA) 表示,还是用透射比准确度或透射比误差TA ( 或ΔT) 表示, 都应该指出在多少吸光度或在多少透射比情况下测试。否则, 既会使人在物理概念上的含糊不清,又会给使用者带来极大的麻烦。
但是, 目前仍有许多厂商在给出透射比准确度或透射比误差TA ( 或ΔT)时, 都一律写成±0. 3% T。特别是许多制造厂商对自称是高档紫外可见分光光度计的仪器, 基本上都是写成“ ±0. 3% T ( 0～100% T )”。如日本岛津的UV-2401PC、UV-2450PC、UV-2550PC 等紫外可见分光光度计, 国内的TU1900、UV-2100、UV-760MC 等紫外可见分光光度计等。从理论上讲任何高档紫外可见分光光度计的透射比准确度或透射比误差TA (或ΔT) 不可能在0～100% T 内都能达到±0. 3%T 的透射比准确度。
在紫外可见分光光度计的技术指标表示方法上, 之所以产生错误, 主要原因有两个: 第一, 不甚了解透射比准确度或透射比误差TA (或ΔT) 与透过率真值T 的关系, 不懂得吸光度准确度或吸光度误差AA ( 或ΔA) 与吸光度真值A 的关系。不知道影响透射比误差TA (或ΔT) 和吸光度误差AA ( 或ΔA) 的主要因素。第二, 商业上的需要, 人家给出的都是± 0. 3% T ( 0 ～100% T) , 我如果不这样写, 就会影响销售。
目前国内外都有一些厂商在说明书或仪器样本中称“ 光度准确度” 为“ 测光精度”, 这种称谓混淆了准确度( Accuuracy) 和精密度( Pr ecision ) 的概念。准确度是指的测量值与理论值之差, 该偏差越小说明测量的数据越准确可靠, 或者说光度准确度越高。而精密度是指的分析测试数据的离散性或重复性, 是指同一操作者, 在一次开机中连续重复多次测试某一吸收峰的吸光度值中最大与最小值之差。该差值越小, 说明该仪器的光度重复性越好。“ 光度准确度” 和“ 光度精密度” 二者不能混淆。正确的说法应该是紫外可见分光光度计的“ 光度准确度” 而不能说成“ 测光精度”。
还有人讲“ 紫外可见分光光度计没有准确度, 光度精密度或光度重复性就是光度准确度”。这也是一个错误的。光度精密度或光度重复性是指多次测量中的离散性。如3 次或5 次测量中吸光度的最大值与最小值之差即为光度精密度或光度重复性。而准确度则是指实际测量的吸光度值与真值或理论值之差。Owen 为了说明精密度( Precision ) 和准确度( Accuuracy ) 的区别, 用打靶的例子作了精辟的说明( 见图4-1 )。
二、影响光度准确度的主要因素
影响紫外可见分光光度计光度准确度的主要因素有以下几个方面。
① 仪器的杂散光大小。
② 仪器的光度噪声。
③ 仪器的基线平直度。
④ 仪器的光谱带宽。
⑤ 试样的来源, 包括样品的制备, 取样的方法。
⑥ 样品的制备, 包括称量、容量、溶剂、试剂、pH 值、时间、温度等。
⑦ 比色皿的性能等。
由此可知, 光度准确度或吸光度误差AA ( 或ΔA) 是一个综合性的技术指标。要使用紫外可见分光光度计测得准确可靠的数据, 必须注重上述几个方面的影响。否则, 不可能得到准确可靠的数据。特别应该指出的是, 在给出吸光度误差AA (或ΔA) , 同时也给出透射比误差TA ( 或ΔT) 时, 二者不能相互矛盾。
三、吸光度准确度和透射比准确度的关系
比耳定律指出: ① A = - lg T, 故T = 10 - A ; ②C = ( - 1/ ab) lg T, 故T =10 - abc 。
式①和式②中, A 为吸光度; T 为透射比; a 为摩尔吸光系数; b 为光程;c 为被测试样的浓度。由此可见, A、T、C 之间有着密切的关系。由于A 或T 的测量误差可引起对被测试样浓度C 的测量误差。若设T 的误差为T A ( 或ΔT) , 则可求出不同TA ( 或ΔT) 的情况下, 相对吸光度误差AA/ A ( AA 为吸
光度真值A 与测量值Am 之差) 与A 的关系。或求出不同A 下AA/ A ( 或ΔA/ A) 与TA 的关系。
作者研究了AA/ A 与TA 和A 的关系, 导出了AA/ A 与T A 和A 之间的关系的理论计算公式, 具有普遍的指导意义。
式( 4-9 ) 为吸光度误差AA 与吸光度真值A 和透射比绝对误差T A 关系的理论计算公式。由此可见, AA 与A 和T A 的数学关系式比较复杂; 当TA 一定时,AA 可通过不同的A 求得; 当A 一定时, AA 可通过不同的TA 求得。图4-2 透射比误差ΔT( TA ) 与吸光度误差ΔA 和吸光度真值A0 的关系
作者根据式( 4-9 ) , 计算出了7 种透射比误差下, 透射比误差TA 与吸光度真值A 的关系(即分析测试结果的相对误差) , 绘制了这6 条误差曲线很适用, 可以覆盖目前各国不同厂家制造的、各种不同类型和型号的紫外可见分光光度计的误差关系。分析测试工作者只要知道自
图4-2 透射比误差ΔT( TA ) 与吸光度误差ΔA 和吸光度真值A0 的关系
己使用的仪器的TA ( 制造商都会提供, 最好使用自己测试的数据) , 再根据使用者当时测试的吸光度数据, 就可以从图4-2 查得使用者当时所测数据因为仪器的TA 而引起的相对误差, 从而知道自己分析测试数据的可靠性。如某厂商给出的仪器指标中, TA 为±0. 5% T , 而分析测试要求的准确度为1% , 则可马上从图4-2 上查得该仪器肯定不能满足自己的使用要求; 又如若仪器给出的TA 为±0. 3%T , 但分析测试要求的准确度为1% (相对误差) , 则可马上从图4-2 上查得该仪器因为TA 为±0. 3% T, 由于TA (或ΔT) 的限制, 即使其他因素不产生误差, 它也只能满足对吸光度为0. 25～0. 75A 的试样的分析测试要求; 若试样的吸光度< 0. 25A (浓度偏稀) , 或> 0. 75A ( 浓度偏高) 时,则测量误差都会超过1%。
目前, 国内外许多仪器厂商, 对光度准确度这个非常关键的技术指标经常同时用两种方法表示: 一种是AA ( 或ΔA) , 另一种是TA ( 或ΔT) , 但其中很多二者是自相矛盾的。如日本岛津的UV-3101PC 型紫外可见分光光度计,它给出的光度准确度分别表示为: 吸光度误差AA (或ΔA) 为±0. 002A (0～0. 5A) ; ±0. 004A ( 0. 5～ 1. 0A ) ; 同时又给出透射比误差TA ( 或ΔT) 为±0. 3% T。从图4-2 可知, 这是一组自相矛盾的技术指标。因为, 从图4-2 可查到TA ( 或ΔT) 为±0. 3% T 时, 若要求AA ( 或ΔA) 为±0. 002A, 则只能在0. 2A 内(即在0～0. 2A) 才可达到。不可能在0～0. 5A 内保证AA ( 或
ΔA) 为±0. 002A。同样, TA (或ΔT) 为±0. 3%T 时, 若要求AA ( 或ΔA)为±0. 004A, 则只能在0～0. 45A 内才是可靠的。在试样吸光度为0. 45A 以上时, AA ( 或ΔA) 就超过± 0. 004A, 若在1. 0A 处, 则AA ( 或ΔA) =±0. 0128A, 超过±0. 004A 的3 倍左右。所以, 日本岛津的UV-3101PC 型紫
外可见分光光度计的光度准确度指标中, AA ( 或ΔA) 和TA ( 或ΔT) 是自相矛盾的。同样, 日本日立的U-3400 型紫外可见分光光度计的这一指标也和日本岛津的UV-3101PC 一样是自相矛盾的。而美国P-E 公司的Lambda 9 ,Lambda 900 , 美国Varian 公司的Cary5、Cary500 和Cary6000 等给出的光度准确度指标AA ( 或ΔA) 为±0. 003A ( 1A ) ; TA ( 或ΔT) = ±0. 08% T。从图4-2 可知, 二者比较一致。从表3-7 可查到: 在TA ( 或ΔT) = ±0. 08% T时, AA (或ΔA) 为± 0. 0034A ( 1A ) 。所以, 美国P-E 公司的Lambda 9 ,Lambda 900 , 美国Varian 公司的Cary5、Cary500 和Cary6000 等紫外可见分光光度计仪器给出的光度准确度指标AA ( 或ΔA) 为± 0. 003A ( 1A ) ; TA(或ΔT) = ±0. 08%T 是可靠的。
四、光度准确度测试方法
用于紫外可见分光光度计的光度准确度测试的材料, 应该是纯度高、稳定性好的物质。这些物质中最主要的是铬酸钾( K2 CrO4 , 一般在碱性溶液中)、重铬酸钾( K2 Cr2 O7 , 一般在酸性溶液中) 、硝酸钾、中性滤光片等。在碱性溶液中的铬酸钾是一种好材料, 但是因为含有碱性, 不能储藏在普通玻璃容器
中, 而需要储藏在石英器皿中, 硝酸钾本身不大稳定。这些都限制了它们的使用。因此, 最好选择易于纯化又溶于酸性介质中的物质, 并且它们的稀溶液也是很稳定的。因此, 重铬酸钾的0. 005mol/ L H2 SO4 溶液经常被使用。许多科学家认为, 用紫外滤光片来测试紫外可见分光光度计的光度准确度, 具有很大的优点。因为它们的稳定性更好, 又便于携带, 还有许多优点将在后面讨论。紫外可见分光光度计的光度准确度测试方法, 目前国内外各生产厂家作法不一, 其主要原因是各国的国家标准不同; 如美国国家标准规定: “选择合适的标准参比材料, 在规定的波长处, 连续测10 个吸光度或透射比读数, 取10个读数的平均值, 实际吸光度或透射比与观测值的平均值之差, 即为光度准确度”。美国国家标准还规定了计算光度准确度的标准偏差S 的方法; 规定指出吸光度准确度用AA 表示, 则有
式( 4-10) 、式( 4-11) 中, S 为标准偏差; Ai 或T i 为每次测量时吸光度或透射比的读数值; Aa 或Ta 为吸光度或透射比的平均值; n 为测量次数( 一般取5～7 次)。
美国NBS 规定, 在可见区用930 标准片来测定光度准确度, 其标准透射比值分别为10%、20%、30%的中性玻璃滤光片。规定还指出也可用NBS 的931 , 它是一种溶液。而在紫外区内, 则规定用NBS 的203 来测定光度准确度; 它是一种标准透射比值分别为90%、30%、10% 熔融石英滤光片。此外,美国标准还规定在紫外区内, 用户还可以自己配置高纯度的化合物溶液来测定光度准确度。为此, 美国NBS 已发布了铬酸钾(K2 CrO4 )、重铬酸钾( K2 Cr2 O7 )等标准物质可供选用。
我国在1992 年制订的紫外可见分光光度计国家标准中规定, 用重铬酸钾溶液来测试紫外区的光度准确度, 并明确指出了测试波长。在可见光区规定可用中性滤光片来检测光度准确度, 其标准片的透射比值分别为10%、20%、40%左右; 同时还规定在紫外可见整个区间, 都可用中性滤光片来检测光度准确度, 其标准片的透射比值也分别为10%、20%、40%左右。
安徽省计量测试研究所和国家标准物质研究中心共同研制的紫外光区透射比标准滤光片, TA 优于0. 2% , 稳定性优于0. 1% , 其测试波长分别为270nm、293 nm 和350 nm, 相应的透射比标准值各为11. 4%、3. 9%、52. 9%左右。用来测试日本岛津公司的UV-260 紫外可见分光光度计和无锡高速分析仪器厂生产的WFZ-753 型紫外可见分光光度计的光度准确度, 具体操作时,以空气作参照, 对规定的波长处各测7 次, 取其平均值, 与标准值相减, 则得到各规定的波长处的TA 。而后, 取三个规定波长中最差者作为被测紫外可见分光光度计仪器的透射比准确度。再根据式( 4-2 ) , 求得被测仪器在各规定的波长处的透射比准确度, 然后以三个规定波长中的最差者作为被测仪器的透射比准确度。
影响紫外分光光度计光度准确度的因素很多, 主要因素有杂散光、噪声、基线平直度、光谱带宽等, 将在本章的三至六节进行详细讨论。
五、与光度准确度有关的几个重要问题
( 一) 光度准确度的测试材料
美国NBS 规定测试材料可以是固体标准滤光片, 如930、203 标准片等,也可以是化合物标准溶液, 如铬酸钾、重铬酸钾溶液等, 用户可以任意选择。我国的国家标准也与NBS 相类似。各个国家的标准中, 都各自讲明了固体和液体两者的优缺点。作者认为固体标准滤光片比标准溶液好, 理由如下:
① 固体标准滤光片操作简单, 携带方便。
② 固体标准滤光片可以用空气作参照, 避免了寻找理想参照片基的麻烦。
③ 固体标准滤光片可以得到多个所需要的、较理想的峰或谷。如安徽省计量测试研究所研制的BW2018 标准片, 可以有两个峰一个谷, 且分布均匀(270 nm、293nm、350 nm)。
④ 固体标准滤光片的标准片基本身可以吸收一部分杂散光, 在吸收( 或透射) 峰的强度很小( 或很大) 时, 可以提高光度准确度的测量准确度。
( 二) 光度准确度与光谱带宽的关系
光谱带宽是紫外分光光度计分析误差的主要来源之一。一般来讲, 目前国内外的紫外分光光度计的仪器研究者或制造者, 在给出AA 或TA 时, 都不讲明在什么光谱带宽( SBW) 条件下测量, 这是不对的。
A. Owen 在1988 年指出: “吸光度测量的准确度, 取决于仪器的SBW 与试样的自然带宽( NBW) 的比率。” ( 自然带宽被定义为最大吸收值的1/ 2 处的吸收谱带宽度)。Knowles 和A. Owen 在大量实验的基础上指出: SBW/NBW≤0. 1 时, 吸光度准确度可高达99. 5% ; 如果SBW/ NBW 增大, 则吸光度测量误差会增加。A. Owen 还指出, NBW≥20 时, 2nm 的SBW 对于吸光度的准确测定是足够的, 可满足大约99% 的日常分析。这也是我国药典规定用于药检的紫外可见分光光度计的SBW 一定要求≤2nm 的主要原因。
测量光度准确度时, 必须注意SBW 的选择。具体理由是:
① SBW 小, 则对应的狭缝宽度小, 此时的杂散光也小, 可提高吸光度测量的准确度。
② SBW 小, 对同一自然带宽( NBW) 来讲, 波长准确度会高。因为不同的波长有不同的摩尔吸光系数, 所以, 波长准确度高时, Beer 定律的偏离也会小, 即光度准确度测试误差小。
③ SBW 小, 则对应的狭缝窄, 但单色光的单色性也好, 更能接近单色光, 也可减少Beer 定律的偏离, 提高测量精度。但必须注意, SBW 不能太小, 否则信号弱, 仪器的信噪比小, 灵敏度差。
狭缝宽度是指紫外可见分光光度计狭缝的机械宽度。一般来讲, 紫外可见分光光度计的制造者不会告诉用户仪器的狭缝宽度, 在某种程度上讲, 仪器的狭缝宽度是一个保密数据。但制造商应该或必须告诉用户仪器的光谱带宽与狭缝宽度的关系为
式( 4-13) 中, f 为焦距; m 为光谱级数; d 为光栅常数; q 为衍射角( 有些人用b 表示衍射角)。
所以, SBW 与单色器物镜的焦距f 有关, 而狭缝宽度与单色器物镜的焦距f 无关。
必须指出, 光谱带宽以nm 计, 而狭缝宽度以mm 计, 二者在计量单位上相差100 万倍。所以, 那些称紫外可见分光光度计仪器的狭缝宽度为多少纳米是不对的。
( 三) 光度准确度与波长重复性的关系
在紫外可见分光光度计中, 波长重复性对光度准确度的影响是很大的。在紫外可见分光光度计中的使用过程中, 如选择试样的最大吸收峰作为测试波长, 则在重新设定该波长时, 产生的微小波长差对光度准确度测量的结果影响不大。但如果不是选择被测试样的最大吸收波长作为测试波长, 而是选择最大吸收波长两侧的波长λ侧作为测试波长( 见图4-3 ) , 则同样大小的波长误差会产生很大的光度准确度测量误差。
由图4-3 可知, Δλ1 = Δλ2 , 但ΔA1 n ΔA2 。因此, 在要求高精度测量时,为了得到更好的光度准确度, 一定要注意选用波长重复性好的紫外可见分光光度计仪器。并且, 在分析过程中, 特别要注意选择试样的最大吸收峰处的波长
图4-3 光度准确度测量误差示意
作为测试波长, 否则难以得到令人满意的结果。
( 四) 光度准确度与波长准确度的关系
紫外可见分光光度计的波长准确度是很重要的; 特别在比较仪器时, 波长准确度显得更加重要。因为物质对不同波长的光吸收时, 有不同的摩尔吸光系数。摩尔吸光系数不同, 分析测试的灵敏度就不同。所以, 同一台紫外可见分光光度计, 对同一试样, 不同波长测试, 其结果不一样。同样, 两台波长准确度不同的紫外可见分光光度计, 对同一试样, 在同一波长上测试, 其结果也会不同。所以, 波长准确度在某种程度上讲, 决定光度准确度。