Corning康宁2ml冻存管430488细胞冻存应用

2020/1/9 14:56:45

细胞冻存、解冻方法与细胞计数


一、细胞冷冻保存

1、材料:

生长良好之培养细胞、新鲜培养基、DMSO(Sigma D-2650)、无菌塑料冷冻保存管(Nalgene 5000-0020)、0.4%(w/v)trypan blue(GibcoBRL15250-061)、血球计数盘与盖玻片、等速降温机(KRYO10SeriesII)。

2、冷冻保存方法:

(1)传统方法:冷存管置于4℃10分钟→ -20℃30分钟→ -80℃16~18小时(或隔夜)→液氮槽vaporphase长期储存。-20℃不可超过1小时,以防止冰晶过大,造成细胞大量si亡,亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中,惟存活率稍微降低一些。

(2)程序降温:利用已设定程序的等速降温机以-1~-3℃/分钟之速度由室温降至(-80℃以下)-120℃,再放在液氮槽vaporphase长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。

3、步骤:

(1)冷冻前一日前更换半量或全量培养基,观察细胞生长情形。

(2)配制冷冻保存溶液(使用前配制):将DMSO加入新鲜培养基中,zui后浓度为5~10%,混合均匀,置于室温下待用。

(3)依细胞继代培养之操作,收集培养之细胞,取少量细胞悬浮液(约0.1ml)计数细胞浓度及冻前存活率。

(4)离心,去除上清液,加入适量冷冻保存溶液,使细胞浓度为1~5×106cells/ml,混合均匀,分装于已标示完全之冷冻保存管中,1ml/vial,并取少量细胞悬浮液作污染检测。

4、注意事项:

(1)欲冷冻保存之细胞应在生长良好(logphase)且存活率高之状态,约为80–90%致密度。

(2)冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质,例如hybridoma应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。

(3)注意冷冻保护剂之品质。DMSO应为试剂级等级,无菌且无色(以0.22micron FGLP flon过滤或是直接购买无菌产品,如Sigma D-2650),以5~10ml小体积分装,4℃避光保存,勿作多次解冻。Glycerol亦应为试剂级等级,以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用,因长期储存后对细胞会有毒性。

(4)冷冻保存之细胞浓度:
①normal human fibroblast:1~3×106cells/ml
②hybridoma:1~3×106cells/ml,细胞浓度不要太高,某些hybridoma会因冷冻浓度太高而在解冻24小时后si去。
③adherent tumor lines:5~7×106,依细胞种类而异。Adenocarcinoma解冻后须较高之浓度,而HeLa只需1~3×106cells/ml
④other suspensions:5~10×106cells/ml,human lymphocyte须至少5×106cells/ml。

(5)冷冻保护剂浓度为5或10%DMSO,若是不确定细胞之冷冻条件,在做冷冻保存之同时,亦应作一个backup culture,以防止冷冻失败。

二、冷冻细胞活化

1、冷冻细胞之活化原则为快速解冻,以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害,导致细胞之si亡。

2、细胞活化后,约需数日,或继代一至二代,其细胞生长或特性表现才会恢复正常(例如产生单株抗体或是其它蛋白质)。

3、材料 :37℃恒温水槽、新鲜培养基、无菌吸管/离心管/培养瓶、液氮或干冰容器 。

4、步骤:

(1)操作人员应戴防护面罩及手套,防止冷冻管可能爆裂之伤害。

(2)自液氮或干冰容器中取出冷冻管,检查盖子是否旋紧,由于热胀冷缩过程,此时盖子易松掉。

(3)将新鲜培养基置于37℃水槽中回温,回温后喷以70%酒精并擦拭之,移入无菌操作台内。

(4)取出冷冻管,立即放入37℃水槽中快速解冻,轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化,以70%酒精擦拭保存管外部,移入无菌操作台内。

(5)取出解冻之细胞悬浮液,缓缓加入有培养基之培养容器内(稀释比例为1:10~1:15),混合均匀,放入CO2培养箱培养。取0.1ml解冻细胞悬浮液作存活测试。

(6)解冻后是否立即去除冷冻保护剂(例如DMSO或glycerol),依细胞种类而异,一般而言,大都不需要立即去除冷冻保护剂。惟若要立即去除,则将解冻之细胞悬浮液加入含有5-10ml培养基之离心管内,离心1000rpm,5分钟,移去上清液,加入新鲜培养基,混合均匀,放入CO2培养箱培养。

(7)若不需立即去除冷冻保存剂,则在解冻培养后隔日更换培养基。

三、细胞计数与存活测试

1、原理:

(1)计算细胞数目可用血球计数盘或是Coultercounter粒子计数器自动计数。

(2)血球计数盘一般有二个chambers,每个chamber中细刻9个1mm2大正方形,其中4个角落之正方形再细刻16个小格,深度均为0.1mm。当chamber上方盖上盖玻片后,每个大正方形之体积为1mm2×0.1mm=1.0x10-4ml。使用时,计数每个大正方形内之细胞数目,乘以稀释倍数,再乘以104,即为每ml中之细胞数目。

(3)存活测试之步骤为dyeexclusion,利用染料会渗入si细胞中而呈色,而活细胞因细胞膜完整,染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之trypan blue染料,如果细胞不易吸收trypan blue,则用红色之Erythrosin bluish。

2、材料:

0.4%w/v trypan blue(GibcoBRL15250-061);Erythosin bluish stain;取0.1gram Erythrosin bluish(SigmaE-9259)及0.05gram preservative methyl paraben(SigmaH-3647)溶于100mlCa++/Mg++freesaline;血球计数盘及盖玻片(Hemocytometerandcoverslip);计数器(counter);低倍倒立显微镜;粒子计数器(Coultercounter,CoulterElectronics)。

3、步骤:

(1)取50μl细胞悬浮液与50μl trypan blue(orErythrosinbluish)等体积混合均匀于1.5ml小离心管中。

(2)取少许混合液(约15μl)自血球计数盘chamber上方凹槽加入,盖上盖玻片,于100倍倒立显微镜下观察,活细胞不染色,无活性细胞则为蓝色(或红色-Erythrosin bluish)。

(3)计数四个大方格之细胞总数,再除4,乘以稀释倍数(至少乘以2,因与trypanblue等体积混合),zui后乘以104,即为每ml中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线上,只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。

注:4大格细胞总数×稀释倍数×104/4=细胞数/ml;每一大格的体积=0.1cm×0.1cm×0.01cm=10-4ml

4、范例:

T75 monolayer culture制成10ml细胞悬浮液,取0.1ml溶液与0.1ml trypan blue混合均匀于试管中,取少许混合液加入血球计数盘,计数四大方格内之细胞数目。

活细胞数/方格:55,62,49,59;无活性细胞数/方格:5,3,4,6;细胞总数=243

平均细胞数/方格=60.75;稀释倍数=2

细胞数/ml:60.75×104×2(稀释倍数)=1.22×106

细胞数/flask(10ml):1.22×106×10ml=12.2×106

存活率:225/243﹦92.6%...

   

 

 

 

康宁Corning 2ml冻存管430659


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