总糖的测定---蒽酮比色法
一、实验目的
掌握蒽酮法测定可溶性糖含量的原理和方法。
二、实验原理
强酸可使糖类脱水生成糠醛,生成的糠醛或羟甲基糖醛与蒽酮脱水缩合,形成糠醛的衍生物,呈蓝绿色,该物质在620nm处有最大吸收。在10-100ug范围内其颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。这一方法有很高的灵敏度,糖含量在 30ug左右就能进行测定,所以可做为微量测糖之用。一般样品少的情况下,采用这一方法比较合适。
三、仪器、试剂和材料
1 .仪器
(1) 分光光度计
(2) 电子顶载天平
(3) 三角瓶: 50m1 X 1
(4) 大试管: 9 支
(5) 试管架,试管夹
(6) 漏斗,漏斗架
(7) 容量瓶: 50 m1 X 2
(8) 刻度吸管: 1m1X3 , 2m1X1 , 5mlX1
(9) 水浴锅
2 .试剂
(1) 葡萄糖标准液: l00ug/ml
(2) 浓硫酸
(3) 蒽酮试剂:0.2g 蒽酮溶于100ml浓 H2SO4中当日配制使用。
3 .材料
小麦分蘖节(或者其它材料)。
四、操作步骤
1 .葡萄糖标准曲线的制作
取7支大试管,按下表数据配制一系列不同浓度的葡萄糖溶液:
管号
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1
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2
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3
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4
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5
|
6
|
7
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葡萄糖标准液( ml )
|
0
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0.1
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0.2
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0.3
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0.4
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0.6
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0.8
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蒸馏水( ml )
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1
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0.9
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0.8
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0.7
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0.6
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0.4
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0.2
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葡萄糖含量( ug )
|
0
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10
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20
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30
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40
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60
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80
|
在每支试管中立即加入蒽酮试剂 4.0m1,迅速浸于冰水浴中冷却,各管加完后一起浸于沸水浴(水浴锅)中,管口加盖玻璃球,以防蒸发。自水浴重新煮沸起,准确煮沸 l0min 取出,用流水冷却,室温放置 10min ,在 620 nm 波长(分光光度计)下比色。以标准葡萄糖含量(ug) 作横坐标,以吸光值作纵坐标,作出标准曲线。
2 .植物样品中可溶性糖的提取
将小麦分蘖节剪碎至 2mm 以下,准确称取 1g(电子天平), 放入 50m1三角瓶中,加沸水25m1,在水浴中加盖煮沸10min ,冷却后过滤,滤液收集在50m1容量瓶中,定容至刻度。吸取提取液2m1(移液枪) ,置另一50m1 容量瓶中,以蒸馏水稀释定容,摇匀测定。
3 .测定
吸取lml 已稀释的提取液于大试管中,加入4.Oml 蒽酮试剂,以下操作同标准曲线制作。比色波长 620nm ,记录吸光度,在标准曲线上查出葡萄糖的含量(ug)。
查表所得糖含量(ug)×稀释倍数
五、注意事项
1 该显色反应非常灵敏,溶液中切勿混入纸屑及尘埃。
2 H 2 SO 4 要用高纯度的。
3 不同糖类与蒽酮的显色有差异,稳定性也不同。加热、比色时间应严格掌握。
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