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几种蛋白质含量测量方法的原理比较

2014/8/22 14:28:01      来宝商城

       

       目前测定蛋白质含量常用的方法有凯氏定氮法、双缩脲法(Biuret)、紫外吸收法、考马斯亮蓝法( Bradford)、Folin酚试剂法。
       一、 凯氏定氮法。实验原理 :蛋白质是含氮的有机化合物,食品与硫酸和催化剂一同加热消化,使蛋白质分解,分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵,然后碱化蒸馏使氨游离,用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定,根据酸的消耗量乘以换算系数,即为蛋白质含量。
       二、 双缩脲法(Biuret) 法。实验原理 :双缩脲(NH3CONHCONH3 ) 是两个分子脲经180 ℃左右加热,放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中,双缩脲与CuSO4 形成紫色络合物,称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键,或能够以一个中间碳原子相连的肽键,这类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关,故可用来测定蛋白质含量。
       三、紫外吸收法法。实验原理 :蛋白质分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键,使蛋白质具有吸收紫外光的性质,吸收峰在280nm 处,其吸光度(即光密度值) 与蛋白质含量成正比。此外,蛋白质溶液在238nm 的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下,蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系,可以进行蛋白质含量的测定。
同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的,虽然经过校正,测定的结果还是存在一定的误差。

       四、考马斯亮蓝法( Bradford)法。实验原理 : Bradford 法是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。考马斯亮蓝是一种有机染料,在游离状态下呈红色,在稀酸溶液中与蛋白质的碱性氨基酸( 特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基结合后变为蓝色,其最大吸收波长从465 nm 变为595 nm, 蛋白质在1~1 000 μg 范围内, 蛋白质-色素结合物在595 nm波长下的吸光度与蛋白质含量成正比,故可用于蛋白质的定量测定。
       五、Folin酚试剂法法。实验原理 :Folin-酚试剂法测定蛋白质含量是双缩脲法的发民,所用的试剂是由两部分组成的。第一部分相当于双缩脲试剂,第二部分为Folin-酚试剂(磷钨酸和磷钼酸混合液)。因此,反应的程序也是分两步进行的。第一步相当于双缩脲反应,在碱性条件下蛋白质中的肽键与Cu2+作用生成络合物;第二步是基于Folin试剂(磷钼酸和磷钨酸试剂)在碱性条件下极不稳定,易被酚类化合物还原生成钼蓝和钨蓝混合物 (呈蓝色反应)。由于蛋白质中含有带酚羟基的酪氨酸,故有此呈色反应。而且溶液颜色的深浅与蛋白质的含量成正比关系。此法也适用于测定酪氨酸和色氨酸的含量。

标签:蛋白质含量检测蛋白质检测方法原理      阅读量:2343
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