实验设备:CO2培养箱,生物安全柜,手套,酒精灯,吸管,移液管(5ml,10ml),50mL离心管,培养瓶(25cm2),移液枪,离心机,计时器,真空泵,抽滤瓶,水浴锅,记号笔,冰箱
技术原理: 细胞在培养瓶长成致密单层后,为使细胞能继续生长并扩大细胞数量,必须进行传代(再培养)。
细胞传代培养作用:1 细胞种保存 2 利用培养细胞进行各种实验的必经过程。
实验步骤:以Hela细胞为例说明具体实验操作步骤
一.实验前准备工作:
进细胞室先换拖鞋,带上手套,用75%的酒精进行表面消毒;
检查酒精灯有无95%酒精,电枪有无电;
将实验过程中用到的实验器材放于安全柜里(实验前安全柜开紫外照15~20min);
将细胞培养液置于37℃水浴锅中预热;
抽滤瓶与真空泵相连,废弃缸套袋。
二.准备实验:
紫外灯关闭半小时后进行实验;
用75%酒精将超净工作台仔细擦试干净;
点燃酒精灯,小心的将细胞从孵箱中拿出。
1.吸除旧的DMEM培养液:
拿出吸管(要拿吸管的上端),插入与抽滤瓶相连的橡胶管中,在酒精灯外焰灼烧灭菌,细胞培养瓶倾斜将吸管插入瓶底部一角,吸出旧的DMEM培养液,将用后的吸管弃于废弃缸里。注意:一定要吸除干净,否则消化时间过长,细胞损伤过大。
2.消化:
拿出5mL移液管,插入电枪中,酒精灯过火灼烧,吸取2mL 0.25%胰酶加入培养瓶中,混匀,放于37℃孵箱中消化5-6min。
取下用后的移液管。
3.中和:
从孵箱中拿出培养瓶,显微镜下观察细胞是否被完全消化下来,5mL移液管(已灭菌)加入3mL DMEM培养液终止消化。反复吹打混匀;吸出中和液转移到50mL离心管中。
4.离心收集细胞:
离心:200×g,3min。将新的DMEM培养液加入新培养瓶中,2mL/瓶(培养瓶底面积为25cm2)。
5.重悬细胞:
离心后吸出中和液,(先吸出表面泡沫,一定注意不要吸出细胞)。加入新DMEM培养液(按2mL/瓶和细胞传代数计算加入的培养液体积),用电枪反复吹打使细胞充分混匀,注意要尽量减少产生气泡。
6.细胞分装:
将混匀后的细胞加入培养瓶中,2mL/瓶,充分混匀。MARK笔标记细胞名称,培养液,细胞传代数,传代日期。
7.细胞培养:
将分装好的细胞于二氧化碳培养箱中培养。培养条件37℃,4% CO2。将0.25%胰酶,细胞培养液密封好放于4℃冰箱中保存。
8.清洁安全柜
实验完毕后,关闭真空泵,用酒精棉球擦干净操作台表面。
9.观察:
每天观察细胞,并记录细胞生长状态。
实验注意事项:
1.紫外消毒过程中会产生臭氧分子,对人体有害。一般情况下,消毒后至少半小时后再进入。
2.所有的实验器材都要经过消毒处理;所有的细胞操作都在安全柜中进行,每一步都要注意不能用手碰到瓶口,培养液不能碰到瓶口,拿培养瓶时要使培养瓶的瓶口微微翘起。
3.细胞消化时间不能太长,要让细胞尽快脱离不舒服的环境;离心时离心机转速不能太高,实验前要设定好离心转速和时间;重悬细胞时要保证细胞完全混匀,在显微镜下观察细胞是一个一个的。
4.传代培养时要注意无菌操作并防止细胞之间的交叉污染。所有操作要尽量靠近酒精灯火焰。每次最好只进行一种细胞的操作。每一种细胞使用一套器材。培养用液应严格分开。
5.每天观察细胞形态,掌握好细胞是否健康的标准:健康细胞的形态饱满,折光性好,生长致密时即可传代。