食品安全国家标准
食品微生物学检验 大肠菌群计数
----- GB 4789.3—2010
前言
本标准代替GB/T 4789.3-2008《食品卫生微生物学检验 大肠菌群计数》。 本标准与GB/T 4789.3-2008相比,主要修改如下:
——修改了标准的中英文名称;
——“第二法 大肠菌群平板计数法”的平板菌落数的选择范围修改为“15 CFU~150 CFU”;
——删除了“第三法 大肠菌群PetrifilmTM 测试片法”。
本标准的附录A、附录B为规范性附录。
本标准所代替标准的历次版本发布情况为:
——GB 4789.3-1984、GB 4789.3-1994、GB /T 4789.3-2003、GB /T 4789.3-2008。
食品安全国家标准
食品微生物学检验 大肠菌群计数
1 范围
本标准规定了食品中大肠菌群(Coliforms)计数的方法。
本标准适用于食品中大肠菌群的计数。
2 术语和定义
2.1大肠菌群 coliforms
在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。
2.2最可能数 most probable number,MPN
基于泊松分布的一种间接计数方法。
3 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:
3.1恒温培养箱:36 ℃±1 ℃。
3.2冰箱:2 ℃~5 ℃。
3.3恒温水浴箱:46 ℃ ±1 ℃。
3.4天平:感量 0.1 g。
3.5均质器。
3.6振荡器。
3.7无菌吸管:1 mL(具 0.01 mL 刻度)、10 mL(具 0.1 mL 刻度)或微量移液器及吸头。
3.8无菌锥形瓶:容量 500 mL。
3.9无菌培养皿:直径 90 mm。
3.10pH 计或 pH 比色管或精密 pH 试纸。
3.11菌落计数器。
4 培养基和试剂
4.1月桂基硫酸盐胰蛋白胨(Lauryl Sulfate Tryptose,LST)肉汤:见附录 A 中 A.1。
4.2煌绿乳糖胆盐(Brilliant Green Lactose Bile,BGLB)肉汤:见附录 A 中 A.2。
4.3结晶紫中性红胆盐琼脂(Violet Red Bile Agar,VRBA):见附录 A 中 A.3。
4.4磷酸盐缓冲液:见附录 A 中 A.4。
4.5无菌生理盐水:见附录 A 中 A.5。
4.6无菌 1 mol/L NaOH:见附录 A 中 A.6。
4.7无菌 1 mol/L HCl:见附录 A 中 A.7。
第一法 大肠菌群 MPN 计数法
5检验程序
6 操作步骤
6.1样品的稀释
6.1.1固体和半固体样品:称取 25 g 样品,放入盛有 225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内, 8000 r/min~10000 r/min 均质 1 min~2 min,或放入盛有 225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋 中,用拍击式均质器拍打 1 min~2 min,制成 1:10 的样品匀液。
6.1.2液体样品:以无菌吸管吸取 25 mL 样品置盛有 225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶 (瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中,充分混匀,制成 1:10 的样品匀液。
6.1.3样品匀液的 pH 值应在 6.5~7.5 之间,必要时分别用 1 mol/L NaOH 或 1 mol/L HCl 调节。
6.1.4用 1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取 1:10 样品匀液 1 mL,沿管壁缓缓注入 9 mL 磷酸盐缓冲液 或生理盐水的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面),振摇试管或换用 1 支 1 mL 无菌 吸管反复吹打,使其混合均匀,制成 1:100 的样品匀液。
6.1.5根据对样品污染状况的估计,按上述操作,依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释 1 次,换用 1 支 1 mL 无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕,全过程不得超过 15 min。
6.2初发酵试验
每个样品,选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液(液体样品可以选择原液),每个稀释度接种3 管月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤,每管接种1mL(如接种量超过1 mL,则用双料LST肉汤),36 ℃±1 ℃培养24 h±2 h,观察倒管内是否有气泡产生,24 h±2 h产气者进行复发酵试验,如未产气则继续 培养至48 h±2 h,产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。
6.3复发酵试验
用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环,移种于煌绿乳糖胆盐肉汤(BGLB)管中,36 ℃±1 ℃培养48 h±2 h,观察产气情况。产气者,计为大肠菌群阳性管。
6.4大肠菌群最可能数(MPN)的报告
按6.3确证的大肠菌群LST阳性管数,检索MPN表(见附录B),报告每g(mL)样品中大肠菌群的MPN值。
第二法 大肠菌群平板计数法
7 检验程序
8 操作步骤
8.1 样品的稀释
按6.1进行。
8.2平板计数
8.2.1选取2个~3个适宜的连续稀释度, 每个稀释度接种2个无菌平皿,每皿1 mL。同时取1 mL生理盐 水加入无菌平皿作空白对照。
8.2.2及时将15 mL~20 mL冷至46 ℃的结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)约倾注于每个平皿中。小心 旋转平皿,将培养基与样液充分混匀,待琼脂凝固后,再加3 mL~4 mLVRBA覆盖平板表层。翻转平 板,置于36 ℃±1 ℃培养18 h~24 h。
8.3平板菌落数的选择
选取菌落数在 15 CFU~150 CFU 之间的平板,分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。 典型菌落为紫红色,菌落周围有红色的胆盐沉淀环,菌落直径为 0.5 mm 或更大。
8.4证实试验
从VRBA 平板上挑取 10 个不同类型的典型和可疑菌落,分别移种于 BGLB 肉汤管内,36 ℃±1 ℃ 培养 24 h~48 h,观察产气情况。凡 BGLB 肉汤管产气,即可报告为大肠菌群阳性。
8.5大肠菌群平板计数的报告
经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以8.3中计数的平板菌落数,再乘以稀释倍数,即为每g (mL)样品中大肠菌群数。例:10-4样品稀释液1 mL,在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落,挑取 其中10个接种BGLB肉汤管,证实有6个阳性管,则该样品的大肠菌群数为:100×6/10×104/g(mL)=6.0×105 CFU/g(mL)。
附录A
(规范性附录)
培养基和试剂
A.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤
A.1.1 成分
胰蛋白胨或胰酪胨 20.0 g
氯化钠 5.0 g
乳糖 5.0 g
磷酸氢二钾(K2HPO4) 2.75 g
磷酸二氢钾(KH2PO4) 2.75 g
月桂基硫酸钠 0.1 g
蒸馏水 1 000 mL
pH 6.8±0.2
A.1.2 制法
将上述成分溶解于蒸馏水中,调节pH。分装到有玻璃小导管的试管中,每管10mL,121 ℃高压 灭菌 15 min。
A.2 煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤
A.2.1 成分
蛋白胨 10.0 g
乳糖 10.0 g
牛胆粉(oxgall或oxbile)溶液 200 mL
0.1%煌绿水溶液 13.3 mL
蒸馏水 800 mL
pH 7.2±0.1
A.2.2 制法
将蛋白胨、乳糖溶于约500 mL蒸馏水中,加入牛胆粉溶液200 mL(将20.0 g脱水牛胆粉溶于200 mL蒸馏水中,调节pH至7.0~7.5),用蒸馏水稀释到975 mL,调节pH,再加入0.1%煌绿水溶液13.3 mL,用蒸馏水补足到1 000 mL,用棉花过滤后,分装到有玻璃小倒管的试管中,每管10 mL。121 ℃高压灭 菌15 min。
A.3 结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)
A.3.1 成分
蛋白胨 7.0 g
酵母膏 3.0 g
乳糖 10.0 g
氯化钠 5.0 g
胆盐或3号胆盐 1.5 g
中性红 0.03 g
结晶紫 0.002 g
琼脂 15 g~18 g
蒸馏水 1 000 mL
pH 7.4±0.1
A.3.2 制法
将上述成分溶于蒸馏水中,静置几分钟,充分搅拌,调节pH。煮沸2 min,将培养基冷却至45 ℃~ 50 ℃倾注平板。使用前临时制备,不得超过3 h。
A.4 磷酸盐缓冲液
A.4.1 成分
磷酸二氢钾(KH2PO4) 34.0 g
蒸馏水 500 mL
pH 7.2
A.4.2 制法
贮存液:称取34.0 g的磷酸二氢钾溶于500 mL蒸馏水中,用大约175 mL的1 mol/L氢氧化钠溶液调节 pH,用蒸馏水稀释至1 000 mL后贮存于冰箱。
稀释液:取贮存液1.25 mL,用蒸馏水稀释至1 000 mL,分装于适宜容器中,121 ℃高压灭菌15 min。
A.5 无菌生理盐水
A.5.1 成分
氯化钠 8.5 g
蒸馏水 1000 mL
A.5.2 制法
称取8.5g氯化钠溶于1 000 mL蒸馏水中,121 ℃高压灭菌15 min。
A.6 1mol/L NaOH
A.6.1 成分
NaOH 40.0 g
蒸馏水 1000 mL
A.6.2 制法
称取40 g氢氧化钠溶于1 000 mL蒸馏水中,121 ℃高压灭菌15 min。
A.7 1mol/L HCl
A.7.1 成分
HCl 90 mL
蒸馏水 1000 mL
A.7.2 制法
移取浓盐酸90 mL,用蒸馏水稀释至1 000 mL,121 ℃高压灭菌15 min。
附录B (规范性附录) 大肠菌群最可能数(MPN)检索表
B.1 大肠菌群最可能数(MPN)检索表
每g(mL)检样中大肠菌群最可能数(MPN)的检索见表B.1。
表B.1 大肠菌群最可能数(MPN)检索表
阳性管数 | MPN | 95%可信限 | 阳性管数 | MPN | 95%可信限 |
0.1 | 0.01 | 0.001 | 下限 | 上限 | 0.1 | 0.01 | 0.001 | 下限 | 上限 |
|
|
0 | 0 | 0 | <3.0 | -- | 9.5 | 2 | 2 | 0 | 21 | 4.5 | 42 |
0 | 0 | 1 | 3 | 0.15 | 9.6 | 2 | 2 | 1 | 28 | 8.7 | 94 |
0 | 1 | 0 | 3 | 0.15 | 11 | 2 | 2 | 2 | 35 | 8.7 | 94 |
0 | 1 | 1 | 6.1 | 1.2 | 18 | 2 | 3 | 0 | 29 | 8.7 | 94 |
0 | 2 | 0 | 6.2 | 1.2 | 18 | 2 | 3 | 1 | 36 | 8.7 | 94 |
0 | 3 | 0 | 9.4 | 3.6 | 38 | 3 | 0 | 0 | 23 | 4.6 | 94 |
1 | 0 | 0 | 3.6 | 0.17 | 18 | 3 | 0 | 1 | 38 | 8.7 | 110 |
1 | 0 | 1 | 7.2 | 1.3 | 18 | 3 | 0 | 2 | 64 | 17 | 180 |
1 | 0 | 2 | 11 | 3.6 | 38 | 3 | 1 | 0 | 43 | 9 | 180 |
1 | 1 | 0 | 7.4 | 1.3 | 20 | 3 | 1 | 1 | 75 | 17 | 200 |
1 | 1 | 1 | 11 | 3.6 | 38 | 3 | 1 | 2 | 120 | 37 | 420 |
1 | 2 | 0 | 11 | 3.6 | 42 | 3 | 1 | 3 | 160 | 40 | 420 |
1 | 2 | 1 | 15 | 4.5 | 42 | 3 | 2 | 0 | 93 | 18 | 420 |
1 | 3 | 0 | 16 | 4.5 | 42 | 3 | 2 | 1 | 150 | 37 | 420 |
2 | 0 | 0 | 9.2 | 1.4 | 38 | 3 | 2 | 2 | 210 | 40 | 430 |
2 | 0 | 1 | 14 | 3.6 | 42 | 3 | 2 | 3 | 290 | 90 | 1,000 |
2 | 0 | 2 | 20 | 4.5 | 42 | 3 | 3 | 0 | 240 | 42 | 1,000 |
2 | 1 | 0 | 15 | 3.7 | 42 | 3 | 3 | 1 | 460 | 90 | 2,000 |
2 | 1 | 1 | 20 | 4.5 | 42 | 3 | 3 | 2 | 1100 | 180 | 4,100 |
2 | 1 | 2 | 27 | 8.7 | 94 | 3 | 3 | 3 | >1100 | 420 | -- |
注 1:本表采用 3 个稀释度[0.1 g(mL)、0.01 g(mL)和 0.001 g(mL)],每个稀释度接种 3 管。 |
注 2:表内所列检样量如改用 l g (mL)、0.1 g(mL)和 0.01 g(mL)时,表内数字应相应降低 10 倍;如改用 0.01 g(mL)、0.001 g(mL)、0.0001 g(mL)时,则表内数字应相应增高 10 倍,其余类推。 |