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食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数

2016/3/8 13:50:12      来宝商城

 

食品安全国家标准

食品微生物学检验 大肠菌群计数

                                               ----- GB 4789.3—2010

                                      前言

 

本标准代替GB/T 4789.3-2008《食品卫生微生物学检验 大肠菌群计数》。 本标准与GB/T 4789.3-2008相比,主要修改如下:

——修改了标准的中英文名称;

——“第二法 大肠菌群平板计数法”的平板菌落数的选择范围修改为“15 CFU~150 CFU”; 

——删除了“第三法 大肠菌群PetrifilmTM 测试片法”。 

本标准的附录A、附录B为规范性附录。

本标准所代替标准的历次版本发布情况为:

——GB 4789.3-1984、GB 4789.3-1994、GB /T 4789.3-2003、GB /T 4789.3-2008。

 

食品安全国家标准

食品微生物学检验  大肠菌群计数

1  范围

本标准规定了食品中大肠菌群(Coliforms)计数的方法。

本标准适用于食品中大肠菌群的计数。

2  术语和定义

2.1大肠菌群 coliforms

在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。

2.2最可能数 most probable number,MPN

基于泊松分布的一种间接计数方法。

3  设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:

3.1恒温培养箱:36 ℃±1 ℃。

3.2冰箱:2 ℃~5 ℃。

3.3恒温水浴箱:46 ℃ ±1 ℃。

3.4天平:感量 0.1 g。

3.5均质器。

3.6振荡器。

3.7无菌吸管:1 mL(具 0.01 mL 刻度)、10 mL(具 0.1 mL 刻度)或微量移液器及吸头。

3.8无菌锥形瓶:容量 500 mL。

3.9无菌培养皿:直径 90 mm。

3.10pH 计或 pH 比色管或精密 pH 试纸。

3.11菌落计数器。

4  培养基和试剂

4.1月桂基硫酸盐胰蛋白胨(Lauryl Sulfate Tryptose,LST)肉汤:见附录 A 中 A.1。

4.2煌绿乳糖胆盐(Brilliant Green Lactose Bile,BGLB)肉汤:见附录 A 中 A.2。

4.3结晶紫中性红胆盐琼脂(Violet Red Bile Agar,VRBA):见附录 A 中 A.3。

4.4磷酸盐缓冲液:见附录 A 中 A.4。

4.5无菌生理盐水:见附录 A 中 A.5。

4.6无菌 1 mol/L NaOH:见附录 A 中 A.6。

4.7无菌 1 mol/L HCl:见附录 A 中 A.7。

 

第一法 大肠菌群 MPN 计数法

 

5检验程序

大肠菌群计数.png 

6  操作步骤

6.1样品的稀释

6.1.1固体和半固体样品:称取 25 g 样品,放入盛有 225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内, 8000 r/min~10000 r/min 均质 1 min~2 min,或放入盛有 225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋 中,用拍击式均质器拍打 1 min~2 min,制成 1:10 的样品匀液。

6.1.2液体样品:以无菌吸管吸取 25 mL 样品置盛有 225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶 (瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中,充分混匀,制成 1:10 的样品匀液。

6.1.3样品匀液的 pH 值应在 6.5~7.5 之间,必要时分别用 1 mol/L NaOH 或 1 mol/L HCl 调节。

6.1.4用 1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取 1:10 样品匀液 1 mL,沿管壁缓缓注入 9 mL 磷酸盐缓冲液 或生理盐水的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面),振摇试管或换用 1 支 1 mL 无菌 吸管反复吹打,使其混合均匀,制成 1:100 的样品匀液。

6.1.5根据对样品污染状况的估计,按上述操作,依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释 1 次,换用 1 支 1 mL 无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕,全过程不得超过 15 min。

6.2初发酵试验

每个样品,选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液(液体样品可以选择原液),每个稀释度接种3 管月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤,每管接种1mL(如接种量超过1 mL,则用双料LST肉汤),36 ℃±1 ℃培养24 h±2 h,观察倒管内是否有气泡产生,24 h±2 h产气者进行复发酵试验,如未产气则继续 培养至48 h±2 h,产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。

6.3复发酵试验

用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环,移种于煌绿乳糖胆盐肉汤(BGLB)管中,36 ℃±1 ℃培养48 h±2 h,观察产气情况。产气者,计为大肠菌群阳性管。

6.4大肠菌群最可能数(MPN)的报告

按6.3确证的大肠菌群LST阳性管数,检索MPN表(见附录B),报告每g(mL)样品中大肠菌群的MPN值。

 

第二法 大肠菌群平板计数法

 

7 检验程序

大肠菌群平板计数法.png 

8   操作步骤 

8.1 样品的稀释

按6.1进行。

8.2平板计数

8.2.1选取2个~3个适宜的连续稀释度, 每个稀释度接种2个无菌平皿,每皿1 mL。同时取1 mL生理盐 水加入无菌平皿作空白对照。

8.2.2及时将15 mL~20 mL冷至46 ℃的结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)约倾注于每个平皿中。小心 旋转平皿,将培养基与样液充分混匀,待琼脂凝固后,再加3 mL~4 mLVRBA覆盖平板表层。翻转平 板,置于36 ℃±1 ℃培养18 h~24 h。

8.3平板菌落数的选择

选取菌落数在 15 CFU~150 CFU 之间的平板,分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。 典型菌落为紫红色,菌落周围有红色的胆盐沉淀环,菌落直径为 0.5 mm 或更大。

8.4证实试验

从VRBA 平板上挑取 10 个不同类型的典型和可疑菌落,分别移种于 BGLB 肉汤管内,36 ℃±1 ℃ 培养 24 h~48 h,观察产气情况。凡 BGLB 肉汤管产气,即可报告为大肠菌群阳性。

8.5大肠菌群平板计数的报告

经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以8.3中计数的平板菌落数,再乘以稀释倍数,即为每g (mL)样品中大肠菌群数。例:10-4样品稀释液1 mL,在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落,挑取 其中10个接种BGLB肉汤管,证实有6个阳性管,则该样品的大肠菌群数为:100×6/10×104/g(mL)=6.0×105 CFU/g(mL)。

 

附录A

(规范性附录)

培养基和试剂

 

A.1  月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤

A.1.1 成分

        胰蛋白胨或胰酪胨                  20.0 g

        氯化钠                            5.0 g

        乳糖                              5.0 g

        磷酸氢二钾(K2HPO4)              2.75 g

        磷酸二氢钾(KH2PO4)              2.75 g

        月桂基硫酸钠                      0.1 g

        蒸馏水                            1 000 mL

        pH 6.8±0.2

A.1.2 制法

        将上述成分溶解于蒸馏水中,调节pH。分装到有玻璃小导管的试管中,每管10mL,121 ℃高压 灭菌 15 min。
A.2
 煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤

A.2.1 成分

        蛋白胨                               10.0 g

        乳糖                                 10.0 g

        牛胆粉(oxgall或oxbile)溶液         200 mL

        0.1%煌绿水溶液                       13.3 mL

        蒸馏水                               800 mL

        pH 7.2±0.1

A.2.2 制法

        将蛋白胨、乳糖溶于约500 mL蒸馏水中,加入牛胆粉溶液200 mL(将20.0 g脱水牛胆粉溶于200 mL蒸馏水中,调节pH至7.0~7.5),用蒸馏水稀释到975 mL,调节pH,再加入0.1%煌绿水溶液13.3 mL,用蒸馏水补足到1 000 mL,用棉花过滤后,分装到有玻璃小倒管的试管中,每管10 mL。121 ℃高压灭 菌15 min。

A.3  结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)

A.3.1 成分

        蛋白胨                                7.0 g

        酵母膏                                3.0 g

        乳糖                                 10.0 g

        氯化钠                                5.0 g

        胆盐或3号胆盐                        1.5 g

        中性红                               0.03 g

        结晶紫                               0.002 g

        琼脂                                15 g~18 g

        蒸馏水                               1 000 mL

        pH 7.4±0.1

A.3.2 制法

        将上述成分溶于蒸馏水中,静置几分钟,充分搅拌,调节pH。煮沸2 min,将培养基冷却至45 ℃~ 50 ℃倾注平板。使用前临时制备,不得超过3 h。

A.4  磷酸盐缓冲液

A.4.1  成分

        磷酸二氢钾(KH2PO4)               34.0 g

        蒸馏水                             500 mL

        pH 7.2

A.4.2 制法

        贮存液:称取34.0 g的磷酸二氢钾溶于500 mL蒸馏水中,用大约175 mL的1 mol/L氢氧化钠溶液调节 pH,用蒸馏水稀释至1 000 mL后贮存于冰箱。

        稀释液:取贮存液1.25 mL,用蒸馏水稀释至1 000 mL,分装于适宜容器中,121 ℃高压灭菌15 min。

A.5  无菌生理盐水

A.5.1  成分

        氯化钠                                8.5 g

        蒸馏水                                1000 mL

A.5.2 制法

        称取8.5g氯化钠溶于1 000 mL蒸馏水中,121 ℃高压灭菌15 min。

A.6  1mol/L NaOH

A.6.1 成分

        NaOH                               40.0 g

        蒸馏水                             1000 mL

A.6.2 制法

        称取40 g氢氧化钠溶于1 000 mL蒸馏水中,121 ℃高压灭菌15 min。

A.7  1mol/L HCl

A.7.1 成分

        HCl                                 90 mL

        蒸馏水                             1000 mL

A.7.2 制法

        移取浓盐酸90 mL,用蒸馏水稀释至1 000 mL,121 ℃高压灭菌15 min。

 

附录B (规范性附录) 大肠菌群最可能数(MPN)检索表

 

B.1  大肠菌群最可能数(MPN)检索表

每g(mL)检样中大肠菌群最可能数(MPN)的检索见表B.1。

 

表B.1 大肠菌群最可能数(MPN)检索表

 

阳性管数

MPN

       95%可信限

阳性管数

MPN

    95%可信限

0.1

0.01

0.001

下限

上限

0.1

0.01

0.001

下限

上限



0

0

0

<3.0

--

9.5

2

2

0

21

4.5

42

0

0

1

3

0.15

9.6

2

2

1

28

8.7

94

0

1

0

3

0.15

11

2

2

2

35

8.7

94

0

1

1

6.1

1.2

18

2

3

0

29

8.7

94

0

2

0

6.2

1.2

18

2

3

1

36

8.7

94

0

3

0

9.4

3.6

38

3

0

0

23

4.6

94

1

0

0

3.6

0.17

18

3

0

1

38

8.7

110

1

0

1

7.2

1.3

18

3

0

2

64

17

180

1

0

2

11

3.6

38

3

1

0

43

9

180

1

1

0

7.4

1.3

20

3

1

1

75

17

200

1

1

1

11

3.6

38

3

1

2

120

37

420

1

2

0

11

3.6

42

3

1

3

160

40

420

1

2

1

15

4.5

42

3

2

0

93

18

420

1

3

0

16

4.5

42

3

2

1

150

37

420

2

0

0

9.2

1.4

38

3

2

2

210

40

430

2

0

1

14

3.6

42

3

2

3

290

90

1,000

2

0

2

20

4.5

42

3

3

0

240

42

1,000

2

1

0

15

3.7

42

3

3

1

460

90

2,000

2

1

1

20

4.5

42

3

3

2

1100

180

4,100

2

1

2

27

8.7

94

3

3

3

>1100

420

--

注 1:本表采用 3 个稀释度[0.1 g(mL)、0.01 g(mL)和 0.001 g(mL)],每个稀释度接种 3 管。

注 2:表内所列检样量如改用 l g (mL)、0.1 g(mL)和 0.01 g(mL)时,表内数字应相应降低 10 倍;如改用 0.01 g(mL)、0.001 g(mL)、0.0001 g(mL)时,则表内数字应相应增高 10 倍,其余类推。

 


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