食品中黄曲霉毒素B1的检测方案（ELISA法）
黄曲霉毒素B1是中毒性及致癌性最强的物质，已导致严重的食品安全问题。花生、玉米、稻谷、小麦、花生油等粮油食品容易受黄曲霉毒素B1的污染，造成黄曲霉毒素超标。国家质检总局规定，黄曲霉毒素B1是大部分食品的必检项目之一。
黄曲霉毒素的检测，常用的是酶联免疫法（ELISA），应用黄曲霉毒素B1 ELISA 检测试剂盒可达到简单、快速、准确的效果，其检测原理是：在酶标板微孔上预包被黄曲霉毒素 B1 抗原。检测时，加入标准品或样品溶液，黄曲 霉毒素 B1 抗体及酶标记物，包被抗原和加入样本中的黄曲霉 毒素 B1 竞争性地与黄曲霉毒素 B1 抗体结合后，再与酶标记物 结合，经 TMB 底物显色；加入反应终止液，在 450 nm 波长酶 标仪下进行检测，样品中的黄曲霉毒素 B1 浓度与吸收光强度成反比，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出 样品中黄曲霉毒素 B1 的含量。
整个实验室涉及的仪器设备：
酶标仪、黄曲霉毒素B1检测试剂盒、氮吹仪、振荡器、离心机、涡旋仪、粉碎机 、电子天平、移液器、医用冷藏箱、纯水机、恒温箱、通风柜（洗板机、洗瓶机）
实验中需要的试剂：
甲醇、石油醚或正己烷、三氯甲烷或二氯甲烷、去离子水
五、溶液的配制
样本前处理需配制： 配液 1：样品稀释液：将浓缩样品稀释液用去离子水按 1:9 体积比进行稀释（1 份浓缩样品稀释液+9 份去离子水）。
配液 2：洗涤工作液：将浓缩洗涤液用去离子水按 1:9 体积比进 行稀释（1 份浓缩洗涤液+9 份去离子水）。
配液 3：样品提取液：用去离子水将甲醇按 3 : 2 体积比进行稀 释（3 份甲醇+2 份去离子水）用于提取样本中的黄曲霉毒素。
六、样本前处理方法
样本处理前须知：
处理任何样本时，都须注意：
（1）实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更 换吸头。
（2）实验之前须检查各种实验器具是否干净，必须使用洁 净实验器具，以避免污染干扰实验结果。
样本前处理步骤：
（A）谷物（大米、玉米、小米等低脂含量）及配合饲料
1、取 5 g 粉碎样品，加入 25 mL 样品提取液；
2、充分振荡混匀 5-10 min；
3、4000 r/min 离心 5 min，或用定量分析滤纸过滤；
4、取0.2 mL 离心后的上清液或过滤后的滤液加入到1 mL 样 品稀释液中进行稀释并充分混匀；
5、取 50 μL 稀释后的样品待测。
稀释倍数：30
（B）花生、花生饼等油脂高的饲料
1. 取 5 g 粉碎的样品，加入 20 mL 石油醚或正己烷和 25 mL 样品提取液；
2. 充分振荡混匀 5-10 min；
3. 离心或静置分层后去除上层液体；
4. 取0.2 mL 下层液体加入到 1 mL 样品稀释液中进行稀释并 充分混匀；
5. 取 50 μL 稀释后样品待测。
稀释倍数：30
（C）食用油（菜油、麻油、色拉油、花生油等）
1、取 5 g 样品，加入 20 mL 石油醚或正己烷和 25mL 样品提 取液；
2、充分振荡混匀 5-10 min；
3、离心或静置分层后去除上层液体；
4、取0.2 mL 下层液体加入到 1 mL 样品稀释液中进行稀释并 充分混匀；
5、取 50 μL 稀释后样品待测。
稀释倍数：30
（D）酱类、麦类、饼干、糕点等食品或调料，以及饲料浓缩料及 DDGS 等饲料
1、取 5 g 粉碎样品，加入 25 mL 样品提取液；
2、充分振荡混匀 5-10 min；
3、4000 r/min 离心 5 min，或用定量分析滤纸过滤；
4、取 5 mL 离心后的上清液或过滤后的滤液，加入 10 mL 三氯甲烷（或二氯甲烷），充分振荡混匀后静置或离心分层；
5、转移上层液体到另一容器中，下层液留置备用，向上层液中再加入 10 mL 三氯甲烷（或二氯甲烷），充分振荡混匀后静置或离心分层；
6、去除上层液体，合并两次的下层液体并充分混匀；
7、取合并后的下层液体 4 mL 于 50℃氮气下吹干，或水浴蒸干；
8、加入 1 mL 样品提取液充分溶解干燥物；
9、再加入 5 mL 样品稀释液进行稀释并充分混匀；
10、取 50 μL 稀释后样品待测。
稀释倍数：30
（F）葡萄酒、酱油、醋
1、取 5 mL 样品，加入 5 mL 蒸馏水并加入 25 mL 三氯甲烷（或二氯甲烷）；
2、充分振荡混匀 5-10 min；
3、离心或静置分层后去除上层液体；
4、取下层液体 2 mL 于 50℃氮气下吹干，或水浴蒸干；
5、加入 1 mL 样品提取液充分溶解干燥物；
6、再加入 5 mL 样品稀释液进行稀释并充分混匀；
7、取 50 μL 稀释后样品待测。
稀释倍数：15
七、酶联免疫检测步骤
测定前须知：
1、 使用之前将所有试剂和需用微孔板回升至室温。
2、 使用之后立即将所有试剂放回 2~8 ℃。
3、 在使用中不要让微孔干燥。
4、 在 ELISA 分析中的重复性，很大程度上取决于洗板的一致性，正确的洗板操作是 ELISA 测定程序中的要点。
5、 在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖板膜盖住微孔板。
测定步骤：
1、将所需试剂和微孔板从冷藏环境中取出，在室温下平衡30 min，每种液体使用前均须摇匀。注意标准液均需做 2个平行试验。
2、2、加标准品：加标准品/样本 50 mL 到对应的微孔中，再加入酶标记物 50 mL/孔，然后再加入 50 mL/孔抗体工作液，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温避光反应 30 min。
3、洗板：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加洗涤液 250μL/孔，每次浸泡 15~30 s，充分洗涤 4~5 次，用吸水纸拍干。
4、显色：加入底物液 A 液 50 μL/孔，再加底物液 B 液 50 μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置 25℃避光环境反应 15 min。
5、测定：每孔各加 50 μL 终止液，设定酶标仪在 450 nm 处测定 OD 值（建议用 450/630 nm 双波长检测，在 5 min内读完数据）。
八、结果分析
所测得的标准液或样品吸光度的平均值（B）除以第一个标准液（0 标准液）的吸光度（B0）值再乘以 100%，得到百分吸光度值。
百分吸光度值（%）= B/B0 ´100%
以标准品浓度的 10 为底的对数为 X 轴， 百分吸光值为 Y 轴，绘制标准曲线。将样本的百分吸光值代入标准曲线，从标准曲线上读出样本所对应的值，作为 10 的幂，乘以稀释倍数，即为样品中所含黄曲霉 B1 的量。利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样品的准确、快速分析。
十、注意事项
1、 室温低于 20 ℃或试剂及样本没有回到室温（20~25 ℃）会导致所有标准的 OD 值偏低。
2、在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标 准曲线不成线性，重复性不好的现象，所以洗板拍干 后应立即进行下一步操作。
3、反应终止液为 2M 硫酸，避免接触皮肤；若不慎滴漏 到皮肤上，请尽快用水冲洗。
4、不要使用过了有效日期的试剂盒；也不要使用过了有 效期的试剂盒中的任何试剂，掺杂使用过了有效期的试剂盒会引起灵敏度的降低；不要交换使用不同批号 试剂盒中的试剂。
5、保存试剂盒于 2~8 ℃，不要冷冻，将不用的微孔板放 进自封袋重新密封；标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。
6、显色试剂有任何颜色表明发色剂变质，应当弃之；0标准的吸光度（450 nm）值小于 0.5（A450nm< 0.5）时， 表示试剂可能变质。
7、在加入底物液后，一般显色 15 min 即可。若颜色较 浅，可延长反应时间到 20 min（或更长），但不得超 过 30 min；反之，则减短反应时间。
8、该试剂盒最佳反应温度为 25 ℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。