H9 人胚胎干细胞（无饲养层）

细胞特性 1） 来源：人胚胎干细胞 2） 形态：贴壁，呈克隆状 3） 含量：>1x106 个/mL 4） 污染：支原体、细菌、酵母和真菌检测为阴性 5） 规格：T25瓶或者1mL冻存管包装   运输和保存 可选择干冰运输及发送复苏存活细胞方式 （1）干冰运输，收到后立即转入液氮或者-80度冰箱冻存或直接复苏； （2）存活细胞，收到后应继续生长，传代达到细胞生长状态良好时，再进行冻存。具体操作见细胞培养步骤。 （3）收到细胞后请拍照，3天内如果发现污染，请及时拍照与我们联系。   细胞用途： 仅供科研使用。                         细胞接收后的处理： 1） 收到细胞后，请检查是否漏液，如果漏液，请拍照片发给我们。 2） 请先在显微镜下确认细胞生长状态，酒精消毒瓶壁并将T25瓶置于37℃培养约2-3h。 3） 将T25瓶中的细胞培养基离心后，去上清，添加6ml完全培养基，加入新的T25瓶中继续培养。 4)   如果细胞长满80%请及时进行细胞传代.   用 mTeSR1 培养人胚胎干细胞（hESC）和人 iPS 细胞（hiPS） 1. 试剂和材料 mTeSRTM1 培养基试剂盒（产品号#85850）包括： 成分 规格 存放条件 mTeSRTM1 基础培养基（#85851） 400 mL 2-8 ℃ mTeSRTM1 5X 添加物（#85852） 100 mL -20 ℃ 所需的其他试剂和材料 产品 品牌/货号 Cryostor CS10 STEM CELL/07930 温和分离液 STEM CELL/07174 DPBS(不含钙镁离子) GIBCO/14190 DMEM/F12 GIBCO/11330 Y27632 STEM CELL/ 72302 BD Matrigel hESC-qualified Matrix CORNING/354277（BD 该系列产品已被 CORNING 收购） 细胞刮 如，CORNING/3010 另需细胞培养板/瓶/皿，15ml 离心管和移液管等细胞培养耗材。   2. 试剂的制备 2.1 mTeSR1 的制备 2.1.1 在室温 (15 - 25°C) 下或冰箱内 (2 - 8°C) 过夜解冻 mTeSR ?1 5X 添加物（成分编号 #05852）。 如需要，可在无菌条件下将 5X 添加物分装为适量的工作等份，并在 -20°C 下冻存。冷冻的分量须在 3 个月内用完。解冻后的分量应在 1 天内制备成完全的 mTeSR?1 培养基。请勿在解冻后再次冷冻。 2.1.2 在无菌条件下将 100 mL 的 5X 添加物全部解冻后加入到 400 mL 的基础培养基中，形成总共 500 mL 的容量。充分混匀。完全的 mTeSR?1 培养基 在(2 - 8°C) 下储存时可维持稳定状态最多 2 周，或在-20°C 下冷冻时可维持稳定状态最多 6 个月。在室温(15 - 25°C) 下或冰箱内(2 - 8°C) 过夜解冻冷冻的培养基，不要长时间放在 37°C 水浴内加热培养液。 如果在无菌条件下制备，完全的 mTeSR?1 培养基可直接使用，但如需要， 也可使用 0.2 µm 的低蛋白结合过滤器过滤培养基。 2.2 Matrigel 工作液配制和包被 应分装和冷冻保存 BD Matrigel? hESC-qualified matrix（BD 产品号 #354277）。有关分装的完整说明和建议，请查阅与 BD Matrigel? 同时提供的产品说明书。分装后的小包装可在-70°C 下最多储存 6 个月。 将一份BD Matrigel? 加入到25 mL 的DMEM/F12 中，这足以包被四个6 孔培养板（1 mL／孔）或三个 100 mm 培养皿（8 mL／培养皿）。 （1） 将 25 mL 的稀释培养基（DMEM/F12；产品号#11330 ）分装入离心管放在冰上。 （2） 将一份分装后的 BD Matrigel?自-70°C 取出 ，在冰上解冻，直到成为液体，然后将解冻后的 BD Matrigel? 加入到冷稀释培养基（在 50 mL 的试管中）中，充分混匀。如需要，可用冷培养基冲洗 EP 管。 （3） 立即用稀释后的 BD Matrigel? 溶液包被组织培养板。对于 6 孔培养板，每个孔使用 1 mL 稀释后的 BD Matrigel?；对于 100 mm 培养板， 每个培养板使用 8 mL 稀释后的 BD Matrigel?。旋动培养板，以使 BD Matrigel? 溶液均匀地分布在表面上。 要包被其他尺寸的组织培养皿，则按照需要包被的培养皿的表面积决定稀释后的 BD Matrigel?用量。 （4） 使用前，包被的培养板应放在培养箱(37°C) 下至少 1 个小时。请勿让培养板脱水。在培养板可供使用之前，请勿移除 BD Matrigel? 溶液。 如果不立即使用，培养板必须密封，以防止脱水（如利用 Parafilm®）。包被后的培养板可在 2 - 8°C 下最多储存 7 天。 如果 BD Matrigel?溶液并未完全覆盖表面，则无法实现最佳的 hPSC 培养；因此，不建议使用含有溶液已蒸发区域的培养板。 （5） 轻轻地将培养板向一个角落倾斜，使过剩的 BD Matrigel ? 溶液汇聚在那个角落。用一次性移液管或通过抽取移除溶液。确保移液枪头不刮到已包被的表面。立即加入 mTeSR?1 培养基和细胞。 如果已将培养板在 2 - 8°C 下储存，则在移除 BD Matrigel?溶液之前， 将培养板在培养箱 (37°C) 下放置 30 分钟。 2.3 配制 Y27632 溶液 Y27632 粉末溶解在 DPBS 中，配成浓度为 10mM 的储存液，0.22um 滤膜过滤除菌。分装后冷冻于-20°C，6 个月内使用。 Y27632 提高复苏和传代后的克隆形成率，所以只在复苏步骤和传代步骤添加，换液时不添加 。   3. 解冻复苏 hES /hiPS 在开始操作程序之前，将所有试管、加热后的培养基和培养板准备好，以确保尽快完成解冻程序。 （1） 快速在 37°C 水浴槽中解冻 hPSC，方法是轻柔持续地摇动冷冻管，直到 只剩下一个小冷冻团。从水浴槽中取出冷冻管，用 70% 乙醇擦拭，以进行消毒。 （2） 使用一个 1 mL 的移液管将冷冻管中的内容物转移至一个 15 mL 锥形试管中, 过程必须轻柔防止吹散细胞团。 （3） 将 5 - 7 mL 温暖的 mTeSR?1 逐滴加入试管中，在加入培养基的同时轻柔混匀。 （4） 在室温(15 - 25°C) 下，以 300 x g 离心细胞 5 分钟。 （5） 吸出培养基，使细胞团保持完整。使用一个 1 mL 的移液管，轻轻地将细胞重新悬浮在 1 - 2 mL 的 mTeSR?1 中，确保维持细胞的团块状态。根据最终培养细胞的液体体积，加入 ROCK inhibitor Y27632, 终浓度为 10uM （6） 轻轻地将培养板/皿向一个角落倾斜，使过剩的 BD Matrigel? 溶液汇聚在那个角落，从而从已包被的组织培养板中移除 BD Matrigel?。使用一次性移液管或通过抽取移除溶液。确保移液枪头不刮到已包被的表面。 如果已将培养板在 2 - 8°C 下储存，则在移除 BD Matrigel?溶液之前，将培养板在培养箱 (37°C) 下 放置 30 分钟。 （7） 将含有细胞聚集体的培养基转移至 BD Matrigel? 包被的培养器皿上。一般一支冻存管细胞复苏到一个 T25 培养瓶或 6 孔板中的 2 个孔。 （8） 将培养板放在 37°C 培养箱中，然后快速地左右、前后移动培养板，以均匀地将细胞团分布在各个孔内。在 37°C、5% CO2 和 95% 湿度的条件下培养细胞。 （9） 每天更换培养基(不需要再添加 Y27632)。在解冻后大约 5 - 7 天内检查可进行传代的未分化集落（有密集的中心）。 如果在解冻后仅观察到很少的未分化集落，则可能需要只选择这些集落进行传代，并将它们重新放在新的 BD Matrigel?包被的培养板大小相同的孔中。 （10） 每天换液。   4. 用 mTeSR1 对 hES/hiPS 进行传代 在 mTeSR?1 中生长的细胞当集落变得较大、中心变得密集和明亮（对比其边缘）而相邻的集落开始融合时，这时可进行传代。根据接种的细胞团的大小和密度，传代周期为 5 天左右。如果太早对集落进行传代或传代太过频繁，则细胞可能吸附不好、产量将会减少且细 胞可能分化。如果太晚对集落进行传代，培养物将开始显示分化迹象（特点是细胞类型出现不同的形态）。 （1） 分装足够的 mTeSR?1 以传代细胞。将分装的 mTeSR?1、温和分离液（产品号#07174）和 DMEM/F-12 加热至室温( 25°C 左右)。 （2） 使用显微镜观察确定分化的区域。用毡制粗头笔或透镜标志器在培养板底部标记这些区域。如果培养物品质优异，分化的区域不会超过培养孔的 20%。 （3） 用移液枪头刮除或抽取，去除分化区域。 （4） 从 hPSC 培养物中吸出培养基，然后用 DPBS（不含钙镁离子）冲洗。 （5） 向每个培养瓶内加入温和分离液(每个 T25 加 3ml)，覆盖底面，在室温下静置 1 分钟。 （6） 吸掉温和分离液，然后用 6ml DMEM/F-12 轻轻的洗涤培养皿一次。 （7） 向培养瓶内加适量 mTeSR?1，并用细胞刮（如 Corning 产品号#3010）将细胞集落刮离培养瓶底。 （8） 将分离的细胞聚集体转移至一个 15 mL 锥形试管中，并加入适量 mTeSR ?1 冲洗培养瓶，以收集残留的细胞聚集体。将冲洗液一并收集到 15 mL 离心管内。 轻轻吹打细胞聚集体 2-3 次，调整培养基的体积，以实现适当的分配。根据最终培养细胞的液体体积，加入 ROCK inhibitor Y27632, 终浓度为 10uM。 （9） 将细胞聚集体与 mTeSR?1 接种至新的 BD Matrigel? 包被的培养板上。一般传代周期为 5 天左右，传代比例为 1：3-1：6。如果集落过于密集或过于稀疏，则下一次传代时相应地调整传代比例。请注意，这些指导基于中科院干细胞库 hESC H1 和 H9 以及 hiPS DYR0100 和 DYP0530 细胞系的生长特征，在其他不同的细胞系和实验室之间可能会存在差异。 （10） 快速前后和左右多次移动培养板，以使细胞分散在各个孔的表面。将培养板放在 37°C 培养箱中。确保新接种的集落均匀地分布在 BD Matrigel ?包被的培养板的整个表面。细胞团分布不均匀有可能导致 细胞分化。 （11） 每天换液。 5. 冷冻 hESC 或 hiPS 细胞 （1） 用显微镜观察需要冻存的培养物，确定已分化的区域。用毡制粗头笔或透镜标志器在培养板底部标记这些区域。 如果培养物品质优异，分化的区域不会超过培养孔的 20%。 （2） 用移液枪头刮除或抽取，去除分化区域。 （3） 从培养孔中吸出残留的培养基，然后用 DPBS（不含钙镁离子）冲洗。 （4） 向每个培养瓶内加入温和分离液(每个 T25 加 3ml)，覆盖底面，在室温下静置 1 分钟。 （5） 吸掉温和分离液，然后用 6ml DMEM/F-12 轻轻的洗涤培养皿一次。 （6） 向培养瓶内每个孔内加适量 mTeSR?1，并用细胞刮（如 Corning 产品号 #3010）将细胞集落刮离培养瓶底。 （7） 将分离的细胞聚集体转移至一个 15 mL 锥形试管中，并加入适量 mTeSR?1 冲洗培养瓶，以收集残留的细胞聚集体。将冲洗液一并收集到 15 mL 离心管内。小心地尽量将细胞团保持到最大。 （8） 在室温(15- 25°C) 下，以 300 x g 离心装有细胞聚集体的 15 mL 离心管 5 分钟。离心细胞时，准备和标记冻存管。 （9） 轻轻地吸出上清液，小心保持细胞团完整。 （10） 使用预冷的(2 -8°C) CryoStor?CS10 轻轻地重新悬浮细胞团，然后将细胞悬液转移至冷冻管中。 （11） 将冷冻管置于程序降温盒内（大约-1°C /min）-80°C 冷冻细胞过夜， 然后转移至液氮长期储存。