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重组基因药物中外源性DNA残留量检测

2016/11/3 9:56:05      来宝商城

在进行外源性DNA残留量测定时,可根据供试品具体情况选择下列任何一种方法进行测定。

第一法:DNA探针杂交法

  供试品中的外源性DNA经变性为单链后吸附于固相膜上,在一定条件下可与相匹配的单链DNA复性而重新结合为双链DNA,称为杂交。将特异性单链DNA探针标记后,与吸附在固相膜上的供试品单链DNA杂交,并使用与标记物相应的显示系统显示杂交结果,与已知含量阳性DNA对照比对后,可测定供试品中外源性DNA残留量。

【试剂准备】

【标准品制备】用于探针标记和阳性对照的DNA,由生产供试品用的传代细胞、工程菌或杂交瘤细胞提取纯化获得,其提纯和鉴定可参考《分子克隆实验指南》或《精编分子生物学实验指南》

    将待提取的细胞基质混悬液的细胞浓度调整为每1ml约含107个细胞,如果为细菌,则将其浓度调整为1ml约含108个细胞。量取悬液1ml,离心,在沉淀中加裂解液400μl混匀,37℃作用12-24h后,加入饱和苯酚溶液450μl重复抽提1次,加入三氯甲烷450μl,剧烈振摇混匀,以每分钟10000r离心10min转移上层液体。加入PH5.2的3mol/l醋酸钠溶液40μl,充分混合再加入-20℃以下的污水乙醇1ml,充分混合,-20℃以下作用2小时,以15000r/min离心15min,用适量-20℃70%乙醇溶液洗涤沉淀1次,吹干后,加适量灭菌TE缓冲溶液溶解,RNase酶切,苯酚-三氯甲烷抽提,分子筛纯化DNA,即得。

      1%琼脂糖凝胶电泳法和分光光度法鉴定阳性对照品的DNA纯度:应无RNA和寡糖苷酸存在,A260/A280比值应在 1. 8?2. 0 之间(测定时将供试品稀释至A260为0.2-1.0) 。用于阳性对照和标记探针的DNA在使用前应进行酶切或超声处理,使其片段大小适合于DNA杂交和探针标记。阳性对照品的DNA浓度按下式计算:DNA浓度(μg/ml)=50*A260,阳性对照品可分装与适宜的小管中,-20℃以下保存,长期使用。

【测定方法】1、蛋白酶K预处理,按规定对供试品、阳性对照和阴性对照进行加样,混合后于37℃保温4小时,保证酶切完全。

2、点膜 将预处理的供试品、阳性对照、阴性对照与空白对照于100℃水浴加热10min,迅速冰浴冷却后8000转离心5s,用抽滤加样器点样于杂交膜,晾干后可采用紫外交联法或置80℃真空干烤1h以上

3、杂交显色  阳性对照应显色,阴性对照、空白对照不显色、或显色深度小于阳性DNA对照,供试品与阳性对照对比,显色深度判断外源性DNA的含量。

第二法  荧光染色法

应用双链DNA荧光染料与双链DNA特异结合形成复合物,在波长480mn激 发下产生超强荧光信号,可用荧光酶标仪在波长520nm处进行检测在一定的D NA浓度范围内以及在该荧光染料过量的情况下,荧光强度与DNA浓度成正 比,根据供试品的荧光强度,计算供试品中的DNA残留量。

DNA标准品溶液制备   用TE缓冲液将DNA标准品配成0ng/ml、1.25ng/ml、2.5ng/ml、5.0ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、80ng/ml的标准品溶液。

测定法  精密量取DNA标准品和供试品溶液各400μl于1.5ml离心管中,分别加入新配置的双链DNA荧光染料400μl,混匀后,避光5min,取250μl于96孔酶标板上,并做3个复孔。用荧光酶标仪在激发波长480nm、发射波长520处测定荧光强度。以TE缓冲液测得的荧光强度为本底,测定和记录各测定空的荧光值,求得回归方程,将供试品溶液的荧光强度带入求值。

 

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