渗透压的存在与实际应用以及肾病患者检测渗透压的临床意义

不同粒径黄体酮的制备及评价

摘要

目的 比较不同粒径黄体酮注射液的释放速度和生物利用度。

方法 制备黄体酮纳米级、微米级注射液，通过 X线粉末衍射分析（PXRD）和傅里叶变换红外光谱分析（FTIR）对两者进行表征，经透析法比较两制剂和黄体酮原料药的溶出 速度。

HPLC-MS法测定肌注不同药物后大鼠血浆中药物浓度，计算药代动力学参数，并进行统计学分析。

结果 PXRD和FTIR分析中，两制剂晶型结构基本无变化，晶型稳定。

黄体酮纳米级、微米级注射液在PBS溶液中释放达到90%时分别需要2和4h， 而原料药释放完全需要近40h。

药代动力学实验中，相比市售黄体酮注射液，黄体酮纳米级、微米级注射液的C_max分别提高了 1.8和1.7倍，AUC_0-t分别提高了2.95和1.63倍。两者生物利用度均高于黄体酮注射液。

结论 黄体酮纳米级、微米级注射液 的释放速率显著高于原料药，生物利用度均高于市售注射液。 

先兆流产是妊娠期常见并发症之一，造成先兆 流产的因素多且复杂，其中最常见的因素是由黄体 功能不全引起的孕酮分泌不足，占到了先兆流产的25%。

随着中国全面开放二胎政策，预计未来平 均每年新增的孕妇人数接近250万人。

有研究表 明，年龄是引起自然流产率增加的因素之一。

高龄孕妇由于年龄较大，卵巢功能相应减退，因而妊娠 流产率较高，临床上通过补充黄体酮大多可获得满 意疗效。 

目前，市场上存在的黄体酮剂型有口服胶囊、 阴道凝胶、阴道栓和注射用油性注射液，如Utrogest、 Crinone、Prometrium和Progesterone。

然而，它们或 多或少都存在着一些缺点。

首先，黄体酮口服胶囊吸收差，生物利用度低，肝首过代谢＞90%；其次， 黄体酮阴道内给药患者需保持卧位时应用，使用不便且易泄漏，因而疗效也不理想；如今市场上针对孕妇保胎、预防先兆流产、补充孕酮的普遍方法为注射黄体酮，但由于其难溶性的特点，市售药物均为油性注射液，溶媒注射用油会造成一定的副作用，如刺激性大，注射部位相继出现疼痛、发炎、硬结、红肿和出血等局部变态反应，影响药物吸收，一 定程度上影响了其生物利用度。

临床不良反应问 题多，中国国家食品药品监督管理总局（CFDA）于 2016年11月21日修订黄体酮注射液说明书，要求 新增相关不良反应及注意事项。

因此，制备一种刺激性小、生物利用度高的非油性黄体酮注射液具有广阔的市场前景。 

根据药物溶解度、渗透性特点可将药物分为4 类，即生物药剂学分类体系（biopharmaceuticalclas?sificationsystem，BCS），依据该分类黄体酮属于 BCSⅣ类（低溶解度、低通透性）。

近年来，研究者采取了多种方法提高难溶性药物的溶解度，如将药物制成前体药物或盐、固体分散物、环糊精包合物、脂质传递系统、自乳化或自微乳化体系等。

应用纳米晶体技术增加难溶性药物的溶解 和吸收是众多方法中的一个，在提高药物疗效和生 物利用度的同时还可降低毒副作用。

纳米晶体 药物已有系列产品上市，其操作简便且易于工业化生产。 

纳米晶体药物是采用合适的表面活性剂将纯 的药物颗粒形成一种亚微米的胶体分散体系，不仅 无需载体材料，而且不受包封率的限制，药物剂量 可调范围宽。

纳米晶体的制备方法通常有两种， 即自下而上法（Bottomup）和自上而下法（Topdown）， 后者在医药行业中应用更广泛。

Bottomup法包括 沉淀法和乳化法等，即药物在一种溶液中被析出， 形成均匀细小的沉淀或结晶的方法。

Topdown法则 包括介质研磨法以及高压均质法，即通过一定的机 械力将大粒径的药物粉末粉碎成小的药物粒子。 

本研究采用高压均质法制备不同粒径的黄体酮注 射液，以提高药物的溶出速度和生物利用度，并比较粒径对制剂的影响。

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材料与方法 

1.药物与试剂

黄体酮原料药（纯度：99.1%，批号：130309）、黄 体酮注射液（批号：141223）、注射用油，浙江仙琚制 药股份有限公司；醋酸甲地孕酮标准品（批号： 100171-201204），中国食品药品检定研究院；吐温 80（批号：150403），上海太仓制药厂；蒸馏水，军事 医 学 科 学 院 自 制 ；氯 化 钠 注 射 液（批 号 ： 14121214403），石家庄四药有限公司；PBS溶液，自 制，pH=7.4；乙腈、甲醇（色谱纯），美国J.T.Baker公 司；甲酸（分析纯，批号：040527），北京化学试剂公 司；双蒸水，娃哈哈北京分公司。 

2.仪器

AH110D高压均质机，加拿大ATSEngineering Inc； C₂₅分散乳化均质机，上海恒川机械设备有限公 司；Nano-ZS90粒度仪、MS2000激光粒度仪，均英国 Malvern公司；BP211D型电子天平，德国Sartorius公司； D8VENTURE型X线衍射仪，德国Bruker公司； NicoletiS50型傅里叶变换红外光谱分析仪，美国 Thermo公司； F-33型pH计，北京屹源电子仪器科技 公司；SMC30C型渗透压测定仪，天津天河分析仪器有限公司；LGJ-18C型冷冻干燥机，北京四环科学仪器厂有限公司；SHK-02-Ⅰ型台式空气恒温摇床，北京北方同正生物技术发展有限公司；透析袋MD4414（截流相对分子质量14000），北京瑞达恒辉科技 发展有限公司；WatersXBridge?C₁₈ 柱（4.6mm× 150mm， 5μm），美国Waters公司；Aglilent1200型高 效液相色谱仪、1260型高效液相色谱仪、Agilent G6460型三重四极杆液质联用仪、AgilentPoroshell 120SB-C₁₈色谱柱（4.6mm×150mm， 2.7μm），Agi? lentLC/MSQQQ质谱工作站，均美国安捷伦公司； Sigma1-14高速离心机，美国Sigma公司；Centrivap Console离心浓缩仪，美国Labconco公司；VORTEX genie-2涡旋仪，美国ScientificIndustries公司。 

3.实验动物

Sprague-Dawley（SD）大鼠，体质量180～220g， 9 只，雄性。

军事医学科学院动物实验中心，动物合 格证号：SCXK（京）2007-004。

标准实验环境下，自 由饮水和进食。 

4. 纳米级、微米级黄体酮混悬液的制备 

取2g吐温80于烧杯中，加入约一定量氯化钠 注射液于磁力搅拌器上搅拌，过夜；加入20g黄体酮 搅拌乳化成均匀的混悬液，将药液倒入高压均质机的研磨腔中，约120ml氯化钠注射液少量多次润洗 烧杯后倒入研磨腔中。

从最低研磨压力起，每研磨 5min升高100bar，至500bar时研磨5min，即得到 黄体酮微米级混悬液，收集；纳米级混悬液制备方 法同上，从最低研磨压力起，每研磨5min升高100 bar，至1100bar时开始计时，并于20min时停止，即 为黄体酮纳米级混悬液。 

5.黄体酮混悬液(纳米级、微米级)的表征 

将样品于室温下稀释 1000倍后超声，取1ml样品于专用玻璃皿中并置于 检测池进行粒径、电位的检测。

以注射用氯化钠溶 液为基准试剂，将渗透压测定仪探头浸入供试溶液 中并降至仪器的冷却槽中，启动制冷系统，记录渗 透压数值。

采用电极法测定溶液pH值，测定前后 均用蒸馏水冲洗多次并用滤纸吸干，将电极浸入供 试溶液，记录pH值。

将黄体酮纳米级、微米 级混悬液预先冷冻干燥24h呈白色粉末状，将干燥 后样品与黄体酮原料药分别进行X线粉末衍射 （powderX-raydiffraction，PXRD）检测。

制剂及原料 药样品的XRPD谱图采集采用Cu·Kα1为X线管阴 极，电压220V，扫描速度4°/min，波长为1.5406/cm。 

记录2θ=2°～40°之间的衍射强度曲线。 

将黄体酮纳米级、微米级混悬液冻干粉末与黄体酮原料药分别进行傅里叶变换红外光谱（Fouriertransforminfrared spectroscopy，FTIR）分析，检测器：DTGSKBr，KBr压 片，波数范围：4000~400cm^-1，分辨率： 4 cm^-1，扫描次数为32。 

6.体外释放实验

分别取1ml已稀释为50μg/ml的 黄体酮纳米级、微米级混悬液和原料药与辅料的物 理混合物于预先活化的透析袋中，置于盛有200ml PBS溶液的溶出杯中， 在37℃恒温摇床中以150r/min 振摇，于规定时间点取0.5ml释放外液。

用HPLC法 测定释放液中药物含量，每个样品重复3份，计算累计释放度。

释放度计算公式为： 

参考文献及《中华 人民共和国药典》，确定黄体酮含量测定采用高 效液相色谱法。

具体条件是：色谱柱：WatersXBridge? C₁₈ （4.6mm×150mm， 5μm）；流动相：水-甲醇-乙腈 （25∶35∶40， V/V/V）；检测波长：241nm；流速： 1ml/min； 进样量：20μl；柱温：25°C；保留时间： 4.4min；线性范围： 2.0～150.0μg/ml，回归方程： y=60.231x-53.088， r＞0.999。 

7.药代动力学

SD雄性大鼠饲养在标准实验环 境下，自由进水和采食。

大鼠随机分为3组，每组3只， 分别称重并用20%乌拉坦麻醉，麻醉剂量为0.9ml/ 100g，大腿外侧肌肉注射给药，给药剂量为1.865 mg/kg，分别于0.083、 0.25、 0.5、 1、 2、 4、 8、12、24、36、 48h取血约0.1ml置于肝素化EP管中，1181×g离心 10min后取上清， 

色谱柱：AgilentPoroshell120SB-C₁₈col? umn（4.6mm×150mm， 2.7μm）；流动相： A（0.1%甲 酸水溶液）-B（含0.1%甲酸的乙腈溶液），梯度洗脱 程序见表1；内标：醋酸甲地孕酮（200ng/ml）；流速： 0.4ml/min；进样量： 5μl，柱温：30°C；线性范围： 2～ 5000ng/ml，回归方程： y=0.887041x+0.028667， r＞ 0.999。

气动辅助电喷雾离子化（ESI）； 多反应监测（MRM）；离子极性：正离子；离子反应： 黄体酮（［M+H］⁺， m/z315.2~97.2），碎裂电压123V， 碰撞能量20V；醋酸甲地孕酮（［M+H］⁺， m/z385.2~ 325.3，内标），碎裂电压118V，碰撞能量8V；干燥气 流速：10L/min；干燥气温度：350℃；雾化室压力40 psi；毛细管电压：4000V。 

取50μl血浆样品，加 入100μl乙腈，50μl内标（200ng/ml），涡旋1min混 匀，14463×g条件下离心10min后取上清液于另一 2mlEP管内，并在40°C条件下旋转蒸发3h至干， 挥干样品加入100μl乙腈-水（80∶20）溶液复溶，涡 旋3min后，14463×g离心10min，取5μl上清液进 样分析。 

将实验所得黄体酮血药浓度和时间数据用Gastroplus进行模拟嵌合，以AIC 最小值为拟合度指标，确定房室模型，计算药动学 参数。

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结果

1.粒径、电位等分析 

黄体酮混悬液为白色均匀混悬液体，pH值为 4.0～6.0，渗透压为285～299mosmol/kg。

纳米级混 悬液粒径为（299.5±9.0）nm，PdI为0.245±0.014，zeta 电位为（-36.8±0.3）mV。

微米级混悬液粒径为 （3.604±0.068）μm，span为1.870±0.050，zeta电位为 （-36.1±0.2）mV。

2.X线粉末衍射结果

黄体酮纳米级、微米级混悬液冻干粉末和黄体 酮原料药的X线粉末衍射图见图1，三者均由很多 定形结构的晶型和少量无定形结构组成， 2θ角均有 10.64、12.79、14.50、15.44、16.99、19.04等，三者衍射 峰基本相似，高度吻合，说明黄体酮混悬液在制备 过程中晶型结构未发生改变，其晶型稳定。 

3.傅里叶变换红外光谱分析

黄体酮纳米级、微米级混悬液和原料药的傅 里叶变换红外光谱图（图2）中，黄体酮原料药在 1698cm^-1处表现出尖锐的吸收带，即C=O伸缩振 动；在1663cm^-1处为α， β不饱和醛，有共轭效应；在1662cm^-1表现出多个尖锐吸收峰， 为C=C； 在2943～ 2853cm^-1处表现出C-H的伸缩振动。

根据吸收峰的情况来看，黄体酮混悬液与原料药相比，未出现新的吸收峰且吸收峰未发生位移或消失，说明官能团、结构未发生改变，两制剂中均无新的化学键产 生。

其晶型结构未发生改变，晶型稳定。 

4. 体外释放实验

黄体酮纳米级和微米级混悬液在pH=7.4的磷 酸盐缓冲液中释放迅速，分别于2和4h时释放达到 90%（图3）。

相比纳米级混悬液，微米级混悬液释放略缓，且1h内其释放速度显著低于纳米级混悬液；而黄体酮原料药与辅料的物理混合物释放最为缓慢，接近40h时，释放量才达到85%，在23.17和 33h内分别显著低于黄体酮微米级混悬液和纳米级 混悬液。

5. 药代动力学

黄体酮纳米级、微米级注射液和市售黄体酮注射液的主要药代动力学参数见表2，平均血药浓度-时间曲线见图4。

实验结果表明，黄体酮纳米级注射液的达峰时间为（4.0±4.0）h，达峰浓度为（1327.1±830.6）μg/ml；黄体酮微米级注射液分别为（12.0 ± 0.0）h 和（1267.5±232.0）μg/ml，而市售黄体酮注射液分别为（4.3±3.5）h 和（473.7±363.2）μg/ml。

黄体酮纳米级注射液的C_max和AUC_0-t约为市售黄体酮注射液的2.8和3.95倍，黄体酮微米级注射液的C_max和AUC_0-t约为市售黄体酮注射液的2.7和2.63倍。

由此可见，两者生物利用度均高于黄体酮注射液。

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讨论

参考有关文献，采用“Top-down”法进行药物研磨时，处方中某些稳定剂会引起过敏性休克、毒性等不良反应，而吐温80则可避免，且静脉注射时耐受性良好。

在处方筛选过程中，含有吐温80的药物粒径相对较小，物理稳定性好，因此选为最优处方。

同时，在混悬液中吐温80作为稳定剂可产生一定的渗透压和空间位阻，迫使药物粒子分离，尽可能避免了由药物粒子之间不断相互碰撞而引起的微粒聚集和沉降，且zeta电位的绝对值为26.8 mV（＞20 mV），说明该混悬液具有一定的物理稳定性。

黄体酮纳米级、微米级注射液的pH值范围为4.0～6.0，渗透压摩尔浓度为285～299 mosmol/kg，均符合注射液要求。

X线粉末衍射分析中，黄体酮原料药和纳米级、微米级混悬液特征衍射峰基本相似，吻合度极高。

红外光谱图中，三者吸收峰基本未改变，具有相似的化学结构和官能团，也无新的化学键产生。

以上表征均说明黄体酮纳米级、微米级混悬液在制备的过程中晶型结构未发生改变，晶型稳定。

根据Noyes-Whitney 方程可知，药物的释放速率与其表面积成正比。

随药物粒径减小，饱和溶解度会增加，且粒径小的纳米粒具有更大的表面积，这也会提高药物的饱和溶解度。

例如阿瑞匹坦（aprepitant），当其粒径由5 μm降低至120 nm 的纳米晶时，其比表面积提高了41.5 倍。

有实验报道，当将一种抗菌剂的粒径从2.4 μm降低至300 nm后，该抗菌剂的溶解度增加了近50%。

本实验中当黄体酮微粒大小降低至3 μm甚至300 nm后，随粒径减小，其表面积增大，饱和溶解度升高，进而使药物在水中的释放速率显著快于原料药。

在0.5 h时黄体酮纳米级、微米级混悬液分别释放36.22%、22.05%，1 h时释放了78.86%、42.02%，而此时物理混合物仅释放19.55%，释放速率远低于两者。

在2 h时，黄体酮纳米级混悬液基本释放完全，达到91.06%，微米级混悬液则在4 h时达到92.02%。

而物理混合物释放完全需要超过40 h。

三者释放速率为：纳米级＞微米级＞原料药。

由此可见，黄体酮制成纳米级混悬液后，其释放速度显著增加。

市售黄体酮注射液溶媒为注射用油，一般来说，水溶性注射液较油性注射液吸收快，起效迅速。

油溶性药物一旦注入体内，在生理性酸碱度条件下水溶不足，无法在肌肉组织间液中吸收，药物会大量的沉淀在注射部位，沉淀的黄体酮颗粒也不能立刻分散进入毛细血管中，只能逐渐地经过重新溶解后再吸收，或被吞噬细胞吞噬失去药效，这就影响了药物作用，导致药物作用迟缓，吸收较慢。

本实验中，黄体酮不仅制备为水溶性注射液，促进了药物的吸收，同时药物粒径也降低至微米、纳米级，其比表面积显著增加，药物的释放速率也随之加快。

因而在注射黄体酮纳米级、微米级注射液后，其血药浓度会有一个急速升高的过程，且由于粒径减小，比表面积增加，黄体酮在肌肉组织中的接触面积增大，进而增加了作用部位单位表面积的药物浓度，同时药物在吸收部位的接触时间延长，从而延长了药物生物半衰期，因而药物的生物利用度得以提高。

黄体酮纳米级、微米级注射液中不仅存在小粒径药物，也存在一定量的大粒径药物，当注射液注入体内时，小粒径药物迅速释放被吸收，而大粒径的药物存在一个吸收迟滞，因此有轻微的双峰现象，这是由药物的制剂因素引起的吸收差异。黄体酮为内源性激素，除卵巢外，肾上腺、胎盘均可少量分泌。

本研究中，虽选用雄性大鼠，也不可避免其自身激素分泌的影响，同时，黄体酮又为高变异药物，个体差异较大，但可初步看出药物肌注后大鼠体内的药物代谢趋势，为进一步深入研究打下基础。

本研究通过介质研磨法将难溶性药物黄体酮制备为粒径较小的黄体酮纳米级、微米级混悬液，通过一系列的表征发现其在研磨过程中晶型稳定。

透析法实验中，药物的溶出速率较黄体酮原料药显著提高。

药代动力学实验中，相比市售黄体酮注射液，黄体酮纳米级、微米级注射液的C_max分别提高了1.8 和1.7 倍，AUC_{0- t} 分别提高了2.95 和1.63倍。

由此可见，黄体酮纳米级、微米级注射液生物利用度均有一定程度的提高，为该药的临床研究和相关安全性评价提供了借鉴和基础。