Cas9 蛋白是 RNA 导向的序列特异性双链 DNA 内切酶。向 导 RNA 通过与靶序列互补来识别靶位点，并将 Cas9 蛋白带到靶 DNA 上。 Cas9 蛋白有两个切割活性中心，分别切割靶 DNA 的 两条链从而产生 DNA 双链断裂。切割位点位于目标序列（target sequence）内，离 PAM（NGG）区 3 个碱基。PAM 对于 Cas9 蛋白的识别和切割都是必需的。
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