一、实验原理:
将碱性溶液与肥料样品充分混合,分离蛔虫卵,然后用密度较蛔虫卵密度大的溶液为漂浮液,是蛔虫卵漂浮在溶液的表面,从而收集检验。
二、仪器设备:
往复式振荡器;天平;离心机;抽滤瓶;真空泵;显微镜;恒温培养箱;金属丝圈;高二特曼氏漏斗;微孔火棉胶滤膜及其他试验室常用仪器、物品等。
三、检验步骤:
1、样品处理:
称取5.0 g~10.0 g样品(颗粒较大的样品应先进行研磨),放于容量为50 mL离心管中,注入氢氧化钠溶液25 mL~30 mL,另加玻璃珠约10粒,用橡皮塞塞紧管口,放置在振荡器上,静置30 min后,以200r/min~300r/min频率振荡 10min~15min。振荡完毕,取下离心管上的橡皮塞,用玻璃棒将离心管上的样品充分搅匀,再次用橡皮塞塞紧管口,静置15min~30min后,振荡 10min~15min。
2、离心沉淀:
从振荡器上取下离心管,拔掉橡皮塞,用滴管吸取蒸馏水,将附着于橡皮塞上和管口内壁的样品冲入管中,以2000r/min~2500r/min速度离心3min~5min后,弃去上清液。然后加适量蒸馏水,并用玻璃棒将沉淀物搅起,按上述方法重复洗涤三次。
3、离心漂浮:
往离心管中加入少量饱和硝酸钠溶液,用玻璃棒将沉淀物搅成糊状后,再徐徐添加饱和硝酸钠溶液,随加随搅,直加到离管口约1 cm为止,用饱和硝酸钠溶液冲洗玻璃棒,洗液并入离心管中,以2000r/min~2500r/min速度离心3min~5min。
用金属丝圈不断将离心管表层液膜移于盛有半杯蒸馏水的烧杯中,约30次后,适当增加一些饱和硝酸钠溶液于离心管中,再次搅拌、离心及移置液膜,如此反复操作3次~4次,直到液膜涂片在低倍显微镜下观察不到蛔虫卵为止。
4、抽滤镜检:
将烧杯中混合悬液,通过覆以微孔火棉胶滤膜的高二特曼氏漏斗抽滤。若混合悬液的浑浊度大,可更换滤膜。
抽滤完毕,用弯头镊子将滤膜从漏斗的滤台上小心取下,置于载玻片上,滴加二、三滴甘油溶液,于低倍显微镜下对整张滤膜进行观察和蛔虫卵计数。当观察有蛔虫卵时,将含有蛔虫卵的滤膜进行培养。
5、培养:
在培养皿的底部平铺一层厚约1 cm的脱脂棉,脱脂棉上铺一张直径与培养皿相适的普通滤纸。为防止霉菌和原生动物的繁殖,可加入甲醛溶液或甲醛生理盐水,以浸透滤纸和脱脂棉为宜。
将含蛔虫卵的滤膜平铺在滤纸上,培养皿加盖后置于恒温培养箱中,在28℃~30℃条件下培养,培养过程中经常滴加蒸馏水或甲醛溶液,使滤膜保持潮湿状态。
6、镜检:
培养10 d~15 d,自培养皿中取出滤膜置于载玻片上,滴加甘油溶液,使其透明后,在低倍显微镜下查找蛔虫卵,然后在高倍显微镜下根据形态,鉴定卵的死活,并加以计数。镜检时若感觉视野的亮度和膜的透明度不够,可在载玻片上滴一滴蒸馏水,用盖玻片从滤膜上刮下少许含卵滤渣,与水混合均匀,盖上盖玻片进行镜检。
7、判定:
凡含有幼虫的,都认为是活卵,未孵化或单细胞的都判为死卵。
四、结果计算:
结果见公式(1):
式中:
K—蛔虫卵死亡率,%;
N1—镜检总卵数;
N2—培养后镜检活卵数。