(一) 实验及仪器：
高速冷冻离心机、低温冰箱、液氮罐、研钵、剪刀、镊子、PCR扩增仪、台式离心、恒温水浴锅、微量移液器、培养皿、带帽试管、涂布器、无菌操作台（含酒精灯、接种环、灭菌牙签等）、恒温摇床、1.4ml EP 管、培养皿、电转印、摇床、紫外灯、恒温水浴箱、电泳仪系统、凝胶成像系统等
(一) 实验步骤：
1. 小麦总 RNA 提取（Trizol 法）
1.1 材料：小麦幼苗
1.2 试剂配制及器具处理
① 0.1%的 DEPC H2O（DEPC：焦碳酸二乙酯）
② 器具处理：试剂瓶、量筒、研钵、大小枪头和 1.5ml 和 0.2ml 的 EP 管等用纱布刀、镊子和药匙等 160℃烘烤 6h 以上。
③ 无 RNA 酶灭菌水（DEPC H2O）：用将高温烘烤的玻璃瓶 （180℃×2h）装蒸馏水，然后加入 0.1%的 DEPC（体积/体积），处理过夜后高压灭菌。
④ Trizol 试剂
⑤ 75%乙醇：用新打开的无水乙醇和 DEPC 处理过的水配制 75%乙醇（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。
⑥ 氯仿（最好用新的）。
⑦ 异丙醇（最好用新的）。
1.3 操作步骤
1.3.1 Trizol 法提取总 RNA
① 先在研钵中加入液氮，再将小麦叶片剪成小段在液氮中磨成粉末，用液氮预冷的药匙取 50～100mg 组织粉末加入已盛有 1ml 的 Trizol 液的 EP 管中（注意研磨粉末总体积不能超过所用 Trizol 体积的 10%），充分混合均匀。
② 室温放置 5min，然后加入 200µL 的氯仿，盖紧 EP 管并剧烈摇荡 15 秒钟。
③ 12000rpm 离心 10min，取上层水相于一新的 EP 管中 （千万不要将中间的沉淀层和下层液混入，否则重新离心分离），加入 500µL 异丙醇，温和颠倒混匀。室温放置 10min，12000rpm 离心 10min。
④ 小心地弃去上清液，加入 1ml 的 75%乙醇，涡旋混匀，4℃下 12000rpm 离心 5min。
⑤ 重复步骤④。
⑥ 弃去上清液（尽量将残余液体除去），室温或真空干燥 5~10min （注意不要干燥过分，否则会降低 RNA 的溶解度）。用 30µL DEPC 处理过的水将 RNA 溶解，必要时可 55℃～60 ℃水浴10 min。RNA 可进行 mRNA 分离，或贮存于 70%乙醇并保存于-70℃。
[注意]
① 整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。
② 加氯仿前的匀浆液可在-70℃保存一个月以上RNA 沉淀在70%，乙醇中可在 4℃保存一周，-20℃保存一年。
2. RT-PCR 扩增目的基因 cDNA
2.1 试剂
① RNA 模板
② Olig (dT)18
③ 反转录缓冲液
④ dNTP
⑤ M-MULV 反转录酶
⑥ RNA 抑制剂（RNasin）
⑦ Premix EX Taq DNA 聚合酶
⑧ PCR 特异引物
2.2 操作步骤
1.1.1 RNA 的反转录
采用 Thermo Scientific (Fermentas) RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit
| 6µL（需加入 RNA 约 1mg） |
Total RNA | 1µL |
Oligo dT primer | 5µL |
H2O（nuclease-free） | 12µL |
65℃ 5min，补加下列试剂： |
|
5× Reaction buffer | 4µL |
Ribolock RNase Inhibitor | 1µL |
10mM dNTP Mix | 2µL |
RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase | 1µL |
| 20µL |
42℃ 60min |
|
70℃，5min，-20℃保存 |
|
1.1.2 PCR 扩增目的基因
1.1.2.1 用表达引物扩增目的基因（25µL 体系）
2×PCR Mix | 12.5 |
cDNA | 1 |
引物 GAPDH1-1 | 1 |
引物 GAPDH1-2 | 1 |
ddH2O | 9.5 |
total | 25µL |
PCR程序：
95℃ 1min
95℃ 10s
58℃ 20s 35cycles
72℃ 45s
72℃ 10min
16℃
PCR产物进行电泳并做胶回收