T5 核酸外切酶沿 5’-3’方向降解 DNA，它可降解双链 DNA、单链 DNA 和缺刻的质粒 DNA。它既能从 5’-末端起 始降解 DNA，也能从线性或环状双链 DNA 的切刻或缺口处起始降解 DNA，但不能降解超螺旋双链 DNA。基于以上特性，T5 核酸外切酶可应用于 Gibson 组装。
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