Lambda 核酸外切酶作用于双链 DNA，沿 5´→3´ 方向逐步切去 5´单核苷酸。最适底物是 5´磷酸化的双链 DNA，也能缓慢降解单链 DNA 和非磷酸化底物。该酶不能从 DNA 的切刻或缺口处起始消化。
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