此检测方法适用于粮食、花生及其制品、薯类、豆类、发酵食品及酒类等各种食品中黄曲霉毒素B1 的测定。
此检测方法的实验原理是：试样中的黄曲霉毒素 B1经提取、脱脂、浓缩后与定量特异性抗体反应, 多余的游离抗体则与酶标板内的包被抗原结合, 加人酶标记物和底物后显色, 与标准比较测定含量 。
一、实验中所需要的仪器：
1、小型粉碎机。
2、电动振荡器。
3、酶标仪：内置490 nm滤光片。
4、恒温水浴锅。
5、恒温培养箱。
6、酶标微孔板。
7、微量加样器及配套吸头。
二、实验室中需要配置的试剂：
1、抗黄曲霉毒素B1 单克隆抗体,由卫生部食品卫生监督检验所进行质量控制。
2、人工抗原: AFB1一牛血清白蛋白结合物。
3、黄曲霉毒素B1标准溶液:用甲醇将黄曲霉毒素B1 配制成1mg/mL溶液,再用甲醇一PBS溶液(20十80)稀释至约 1o µg/mL,紫外分光光度计测定此溶液最大吸收峰的光密度值, 代入式（1）计算:
式中:
x 一该溶液中黄曲霉毒素 B1的浓度,单位为微克每毫升(µg/mL) ;
A 一测得的光密度值;
M 一黄曲霉毒素B1的分子量,312 ;
E一摩尔消光系数, 21 800;
f一使用仪器的校正因素。
根据计算将该溶液配制成1oµg/mL标准溶液, 检测时, 用甲醇一PBS溶液将该标准溶液稀释至所需浓度。
4、 三氯甲烷。
5、 甲醇。
6、 石油醚。
7、 牛血清白蛋白(BSA) 。
8、 邻苯二胺(0PD)。
9、 辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗鼠 IgG。
10、碳酸钠。
11、 碳酸氢钠。
12、 磷酸二氢钾。
13、 磷酸氢二钠。
14、 氯化钠。
15、 氯化钾。
16、 过氧化氢(H202)。
17、 硫酸。
18、 ELISA缓冲液如下:
1） 包被缓冲液(pH9. 6碳酸盐缓冲液)的制备:
Na2C03 1.59g
NaHC03 2.93g
加蒸馏水至1000 mL。
2） 磷酸盐缓冲液(pH7.4 PBS)的制备:
KH2P04 0.2g
Na2HP04·12H20 2.9g
NaCl 8.0g
KCl 0.2g
加蒸馏水至1 000 mL。
3） 洗液(PBS-T)的制备: PBS加体积分数为 0. 05%的吐温-20。
4） 抗体稀释液的制备: BSA1.0 g加 PBS-T至1 000 mL。
19、 底物缓冲液的制备如下:
1） A液(0.1 mol/L柠様酸水溶液):柠檬酸(C6H8O7·H20) 21.01 g,加蒸馏水至1 000mL。
2） B液(0.2 mol/L磷酸氢二钠水溶液):Na2HP04·12H20 71.6 g,加蒸馏水至1 000 mL。
3） 用前按 A液十B液十蒸馏水为24. 3十25. 7十50的比例(体积比)配制。
20、 封闭液的制备:同抗体稀释液。
三、分析步骤：
1、取样
试样中污染黄曲霉毒素高的霉粒一-粒可以左右测定结果,而且有毒霉粒的比例小,同时分布不均匀。为避免取样带来的误差,应大量取样,并将该大量试样粉碎,混合均匀,才有可能得到确能代表一批试样的相对可靠的结果,因此采样应注意以下几点 。
1） 根据规定采取有代表性试样。
2） 对局部发霉变质的试样检验时,应单独取样 。
3） 每份分析测定用的试样应从大样经粗碎与连续多次用四分法缩减至 0. 5 kg~1 kg,然后全部粉碎。 粮食试样全部通过20目筛,混匀。花生试样全部通过10目筛,混匀。或将好、坏分别测定,再计算其含量。花生油和花生酱等试样不需制备,但取样时应搅拌均匀 。必要时,每批试样可采取3 份大样作试样制备及分析测定用,以观察所采试样是否具有一定的代表性。
2、 提取
1） 大米和小米(脂肪含量<3. 0%)的提取
试样粉碎后过20目筛,称取20.0 g,加入250 mL具塞锥形瓶中。准确加入60 mL三氯甲烷,盖塞后滴水封严。150 r/min振荡30 min。静置后,用快速定性滤纸过滤于50 mL烧杯中。立即取12 mL滤液(相当4.0 g试样)于75 mL蒸发皿中, 65℃水浴通风挥干。用2.0 mL20%甲醇一PBS分三次(0. 8 mL、0. 7 mL、0. 5 mL)溶解并彻底冲洗蒸发皿中凝结物,移至小试管,加盖振荡后静置待测 。此液每毫升相当2. 0 g试样。
2） 玉米的提取(脂肪含量3. 0%~5.0%)
试样粉碎后过20目筛,称取20.0 g,加入250 mL具塞锥形瓶中,准确加人50. 0 mL甲醇一水(80十20)溶液和15. 0 mL石油醚,盖塞后滴水封严。150 r/min振荡30 min。用快速定性滤纸过滤于125 mL分液漏斗中 。 待分层后,放出下层甲醇一水溶液于50 rmL烧杯中,从中取10. 0mL （相当于4.0g试样)于75 mL蒸发皿中。 以下按上1）中自“65℃水浴通风挥于……"起依法操作。
3） 花生的提取(脂肪含量15. 0%~45. 0%)
试样去売去皮粉碎后称取20.0 g,加入250 mL具塞锥形瓶中, 准确加入100.0 mL 甲醇一水(55十45)溶液和30 mL石油醚,盖塞后滴水封严。150 r/min振荡30 min。静置15 min后用快速定性滤纸过滤于125 mL分液漏斗中 。 待分层后,放出下层甲醇一水溶液于100 mL烧杯中,从中取20. 0 mL (相当于4.0 g试样)置于另一125 mL分液漏斗中,加入20.0 mL三氯甲烷,振揺2 min,静置分层(如有乳化现象可滴加甲醇促使分层) ,放出三氯甲烷于75 mL蒸发皿中 。 再加5. 0 mL三氯 甲烷于分液漏斗中重复振揺提取后,放出三氯甲烷一并于蒸发皿中,以下按上1）自“65℃水浴通风挥干······"起依法操作。
4） 植物油的提取
用小烧杯称取4.0 g试样,用20.0 mL石油醚,将试样移于125 mL分液漏斗中,用20. 0 mL甲醇一水(55十45)溶液分次洗烧杯,溶液一并移于分液漏斗中(精炼油4. 0 g样为4. 525 mL,直接用移液器加入分液漏斗,再加溶剂后振摇),振摇2 min。 静置分层后,放出下层甲醇一水溶液于75 mL素发皿中,再用5.0 mL甲醇一水溶液重复振摇提取一次,提取液一并加人蒸发皿中,以下按上1）自“65℃水浴通风挥干··…·"起依法操作。
5） 其他食品的提取
5.1） 麦类、面粉、薯干、豆类、花生、花生酱等
称取20. 00 g粉碎过筛试样(面粉、花生酱不需粉碎) ,置于250 mL具塞锥形瓶中,加30 mL正己烷或石油醚和100 mL甲醇水溶液,在瓶塞上涂上一层水,盖严防漏。 振荡30 min,静置片刻,以叠成折叠式的快速定性滤纸过滤于分液漏斗中,待下层甲醇水溶液分清后,放出甲醇水溶液于另一具塞锥形瓶内 。取20. 00 mL甲醇水溶液(相当于4 g试样)置于另一125 mL分液漏斗中,加20 mL 三氯甲烷,振揺2 min,静置分层,如出现乳化现象可滴加甲醇促使分层 。 放出三氯甲烷层,经盛有约10 g预先用三氯甲烷湿润的无水硫酸钠的定量慢速滤纸过滤于50 mL蒸发皿中,再加5 mL三氯甲烧于分液漏斗中,重复振摇提取,三氯甲烷层一并滤于蒸发皿中, 最后用少量三氯甲烷洗过滤器,洗液并于蒸发皿中 。 将蒸发皿放在通风柜于65℃水浴上通风挥干,用2.0 mL20%甲醇一PBS分三次(0. 8 mL、0. 7 mL、0. 5 mL)溶解并彻底冲洗蒸发皿中凝结物,移至小试管,加盖振荡后静置待测 。此液每毫升相当2. 0 g试样。
5.2） 酱油、醋
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称取10.00 g试样于小烧杯中,为防止提取时乳化,加 0. 4 g氯化钠,移入分液漏斗中,用15 mL三氯甲烷分次洗涤烧杯,洗液并入分液漏斗中。 以下按5. 1）自''振摇2 min,静置分层……"起依法操作,最后加入2. 5 mL苯一乙脯混合液,此溶液每毫升相当于4 g试样。
5.3） 干酱类(包括豆豉、腐乳制品)
称取20. 00 g研磨均匀的试样,置于250 mL具塞锥形瓶中,加人20 mL正己烷或石油醚与50 mL 甲醇水溶液。 振荡30 min,静置片刻, 以叠成折叠式快速定性滤纸过滤,滤液静置分层后,取24 mL甲醇水层(相当8 g试样,其中包括8 g干酱类本身约含有4 mL水的体积在内)置于分液漏斗中,加入20 mL三氯甲烷,以下按5.1）自“振摇2 min,静置分层······"起依法操作。最后加入2 mL苯一乙腈混合液。 此溶液每毫升相当于4 g试样。
3、 间接竞争性酶联免疫吸附测定(ELISA)
1） 包被微孔板:用 AFB1-BSA人工抗原包被酶标板, 150µL/孔, 4℃过夜。
2） 抗体抗原反应:将黄曲霉毒素B1纯化单克隆抗体稀释后分别
a) 与等量不同浓度的黄曲霉毒素 B1标准溶液用2 mL试管混合振荡后, 4℃静置。此液用于制作黄曲霉毒素B1标准抑制曲线 。
b) 与等量试样提取液用2 mL试管混合振荡后, 4℃静置。此液用于測定试样中黄曲霉毒素 B1含量 。
3） 封闭:已包被的酶标板用洗液洗3次,每次3 min后,加封闭液封闭, 250 µL/孔,置37℃下1 h。
4） 测定:酶标板洗3x3 min后,加抗体抗原反应液(在酶标板的适当孔位加抗体稀释液或 Sp2/0培养上清液作为阴性对照)130 µL/孔, 37℃, 2 h。酶标板洗3X3 min,加酶标二抗[1 : 200(体积分数)]100µL/孔, 1 h。酶标板用洗液洗5x3 min。加底物溶液(10 mg OPD)加25 mL底物缓冲液加37 µL30% H202 , 100µL/孔, 37℃, 15 min,然后加2 mol/L H2S04, 40µL/孔,以终止显色反应, 酶标仪490 nm测出 0D值。
4、 结果计算
黄曲霉毒素 B1 的浓度按式(2)进行计算 。
式中:
c 一黄曲霉毒素 B,含量,单位为纳克(ng) ,对应标准曲线按数值插入法求;
V1一试样提取液的体积,单位为毫升(mL) ;
V2一滴加样液的体积,单位为毫升(mL) ;
D 一稀释倍数;
m 一试样质量,单位为克(g) 。
由于按标准曲线直接求得的黄曲霉毒素 B1 浓度(c1)的单位为纳克每毫升,而测孔中加入的试样提取的体积为 0.065 mL,所以式(2)中
c= 0.065 mL X c1
而V1=2 mL, V2=0,065 mL, D=2, m=4 g代人式(2),则
所以, 在对试样提取完全按本方法进行时, 从标准曲线直接求得的数值 c1 , 即为所测试样中黄曲霉毒素B1的浓度(ng/g)。
注：
1、此检测方法根据现行的食品安全国家标准 GB/T 5009.22-2003 整理，是国标食品中黄曲霉毒素检测的第二法。
2、黄曲霉毒素B1（AFB1）ELISA快速检测试剂盒具有快速、简便、准确和灵敏度高等优点，操作时间短，能最大限度地减少操作误差和工作强度，目前在食品中黄曲霉毒素B1的检测中广泛应用。