实时荧光扩增技术（SAT）-以泌尿生殖道沙眼衣原体为例
1、样本采集：采集标本前2h内不排尿。用于核酸检测的分泌物标本的采集：用特制棉拭子伸入男性尿道口或女性宫颈口采集分泌物样本，采样后用1.5ml生理盐水洗涤。将该混合液震荡混匀后，吸取1ml至另一只装有1ml尿样保存液（SAT试剂盒提供）的样本冷冻保存管中，并混匀；将上述两管样本均至于-20℃保存，用于SAT检测及PCR检测。用于细胞培养标本的采集：将采集分泌物的棉拭子样本洗入衣原体运送培养基中，用于衣原体培养实验。用于核酸检测的尿样标本的采集：采集标本之前2h内不排尿。收集首段尿样约1ml，与1ml尿样保存液（SAT试剂盒提供）混匀，-20℃保存，-20℃保存，SAT检测备用。
2、实验方法
拭子样本及尿样样本同时进行SAT检测实验，实验操作按照试剂盒说明书进行。样本RNA的提取（采用磁珠法核酸提取技术）在半自动核酸提取仪上完成：首先将400ul已加入保存液的尿液或拭子样本与100ul核酸提取液混匀，60℃保存5min；然后室温放置10min，之后将样本依次转移到半自动核酸提取仪上，根据说明书要求进行提取操作。仪器提取核酸RNA完成后，吸取30ul扩增检测液（含磁珠）上机（实时荧光PCR仪）进行扩增检测：FAM通道，42℃，恒温40min，每分钟收集一次荧光信号。结果判断：根据出现荧光的时间（Dt）来判断实验结果，判定标准如下:Dt值≤35为阳性；35≤Dt＜40为可疑（进行复测）；无Dt值（曲线无扩增）判定为阴性。同一病人有拭子样本和尿样样本两个检测结果。
沙眼衣原体细胞培养
1、一般选择Hela229（人宫颈癌细胞）McCoy（小鼠成纤维细胞）进行致密单层细胞制备，最好的制备方法以hela229细胞为例，六孔板75万细胞。
2、接种样本前先用30ug/目录 DEAD-葡聚糖处理细胞30min，作用于暂时提高细胞膜内吞力。
3、去掉DEAD，换5ml未加血清的培养液，加入菌液，菌液的量要根据菌液浓度而定，过高会造成细胞病变过快，提前大量死亡，过少会造成阳性率过低，无法观察或计数。
4、对六孔板进行离心，3000RPM 1238G作用于通过物理作用加速衣原体进入细胞。孵育器中孵育2小时。
5、最后就是更换感染液，感染液相比平时所用的培养液就是多了放线菌酮 浓度1ug/ml 高浓度放线菌酮可以诱导凋亡， 而低浓度的作用是通过抑制蛋白质合成来抑制细胞分裂增殖，是已经长满的细胞不再增多，不然很快就会有细胞应为过渡拥挤而脱落死亡。
6、感染后48-72小时观察结果。衣原体检测方法：沙眼衣原体的一个独特生长特性就是会在增殖过程中代谢积累糖原，所以使用含有碘的染色液就可以将包涵体染色成为红褐色，常用的染色液为卢戈氏染液。此外还可以通过特异的DNA燃料 hoechst 33258来染色，可以看到细胞核以外存在染色区域，典型的包涵体可以被染色成蓝色均匀的块状。
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