食品安全国家标准
食品微生物学检验 沙门氏菌检验(GB 4789.4—2010)
前 言
本标准代替 GB/T 4789.4-2008《食品卫生微生物学检验 沙门氏菌检验》。 本标准与 GB/T 4789.4-2008 相比,主要变化如下:
——修改了标准的中英文名称;
——修改了标准的范围;
——修改了培养基和试剂;
——修改了设备和材料;
——修改了附录 A。
本标准的附录 A、附录 B 为规范性附录。 本标准所代替的历次版本发布情况为:
——GB 4789.4-84、GB 4789.4-1994、GB/T 4789.4-2003、GB/T 4789.4-2008。
范围
本标准规定了食品中沙门氏菌(Salmonella)的检验方法。
本标准适用于食品中沙门氏菌的检验。
设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:
冰箱:2 ℃~5 ℃。
恒温培养箱:36 ℃±1 ℃,42 ℃±1 ℃。
均质器。
振荡器。
电子天平:感量 0.1 g。
无菌锥形瓶:容量 500 mL,250 mL。
无菌吸管:1 mL(具 0.01 mL 刻度)、10 mL(具 0.1 mL 刻度)或微量移液器及吸头。
无菌培养皿:直径 90 mm。
无菌试管:3 mm×50 mm、10 mm×75 mm。
无菌毛细管。
pH 计或 pH 比色管或精密 pH 试纸。
全自动微生物生化鉴定系统。
培养基和试剂
缓冲蛋白胨水(BPW): 见附录 A 中 A.1。
四硫磺酸钠煌绿(TTB)增菌液:见附录 A 中 A.2。
亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液:见附录 A 中 A.3。
亚硫酸铋(BS)琼脂:见附录 A 中 A.4。
HE 琼脂:见附录 A 中 A.5。
木糖赖氨酸脱氧胆盐(XLD)琼脂:见附录 A 中 A.6。
沙门氏菌属显色培养基。
三糖铁(TSI)琼脂:见附录 A 中 A.7。
蛋白胨水、靛基质试剂:见附录 A 中 A.8。
尿素琼脂(pH 7.2):见附录 A 中 A.9。
氰化钾 (KCN) 培养基:见附录 A 中 A.10。
赖氨酸脱羧酶试验培养基:见附录 A 中 A.11。
糖发酵管:见附录 A 中 A.12。
邻硝基酚 β-D 半乳糖苷(ONPG)培养基:见附录 A 中 A.13。
半固体琼脂:见附录 A 中 A.14。
丙二酸钠培养基:见附录 A 中 A.15。
沙门氏菌 O 和 H 诊断血清。
生化鉴定试剂盒。
4 检验程序
沙门氏菌检验程序见图 1。
操作步骤
前增菌
称取 25 g(mL)样品放入盛有 225 mL BPW 的无菌均质杯中,以 8 000 r/min~10 000 r/min 均质 1 min~2 min,或置于盛有 225 mL BPW 的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打 1 min~2 min。若样 品为液态,不需要均质,振荡混匀。如需测定 pH 值,用 1 mol/mL 无菌 NaOH 或 HCl 调 pH 至 6.8±0.2。
无菌操作将样品转至 500 mL 锥形瓶中,如使用均质袋,可直接进行培养,于 36 ℃±1 ℃培养 8 h~ 18h。
如为冷冻产品,应在 45 ℃以下不超过 15 min,或 2 ℃~5 ℃不超过 18 h 解冻。
增菌
轻轻摇动培养过的样品混合物,移取 1 mL,转种于 10 mL TTB 内,于 42 ℃±1 ℃培养 18 h~24 h。同时,另取 1 mL,转种于 10 mL SC 内,于 36 ℃±1 ℃培养 18 h~24 h。
分离
分别用接种环取增菌液 1 环,划线接种于一个 BS 琼脂平板和一个 XLD 琼脂平板(或 HE 琼脂 平板或沙门氏菌属显色培养基平板)。于 36 ℃±1 ℃分别培养 18 h~24 h (XLD 琼脂平板、HE 琼脂 平板、沙门氏菌属显色培养基平板) 或 40 h~48 h (BS 琼脂平板),观察各个平板上生长的菌落, 各个平板上的菌落特征见表 1。
表 1 沙门氏菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落特征
选择性琼脂平板 | 沙门氏菌 |
BS 琼脂 | 菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色,菌落周围培养基可呈黑色或棕色;有些菌株形成灰绿色的菌落,周围培养基不变。 |
HE 琼脂 | 蓝绿色或蓝色,多数菌落中心黑色或几乎全黑色;有些菌株为黄色,中心黑色或几乎全黑色。 |
XLD 琼脂 | 菌落呈粉红色,带或不带黑色中心,有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心,或呈现全部黑色的菌落;有些菌株为黄色菌落,带或不带黑色中心。 |
沙门氏菌属显色培养基 | 按照显色培养基的说明进行判定。 |
5.4 生化试验
5.4.1 自选择性琼脂平板上分别挑取 2 个以上典型或可疑菌落,接种三糖铁琼脂,先在斜面划线, 再于底层穿刺;接种针不要灭菌,直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板,于 36 ℃±1 ℃ 培养 18 h~24 h,必要时可延长至 48 h。在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内,沙门氏菌属 的反应结果见表 2。
表 2 沙门氏菌属在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果
三糖铁琼脂 | 赖氨酸脱羧酶试验培养基 | 初步判断 |
斜面 | 底层 | 产气 | 硫化氢 |
|
K | A | +(-) | +(-) | + | 可疑沙门氏菌属 |
K | A | +(-) | +(-) | - | 可疑沙门氏菌属 |
A | A | +(-) | +(-) | + | 可疑沙门氏菌属 |
A | A | +/- | +/- | - | 非沙门氏菌 |
K | K | +/- | +/- | +/- | 非沙门氏菌 |
注:K:产碱,A:产酸;+:阳性,-:阴性;+(-):多数阳性,少数阴性;+/-:阳性或阴性。 |
5.4.2 接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时,可直接接种蛋白胨水 (供做靛基质试 验)、尿
素琼脂 (pH7.2)、氰化钾 (KCN) 培养基,也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑 取可疑菌落接种。于 36 ℃±1 ℃培养 18 h~24 h,必要时可延长至 48 h,按表 3 判定结果。将已挑菌 落的平板储存于 2 ℃~5 ℃或室温至少保留 24 h,以备必要时复查。
表3 沙门氏菌属生化反应初步鉴别表
反应序号 | 硫化氢(H2S) | 靛基质 | pH 7.2 尿素 | 氰化钾(KCN) | 赖氨酸脱羧酶 |
A1 | + | - | - | - | + |
A2 | + | + | - | - | + |
A3 | - | - | - | - | +/- |
注:+阳性;-阴性;+/-阳性或阴性。 |
5.4.2.1 反应序号 A1:典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCN 和赖氨酸脱羧酶 3 项中有 1 项异常,按表 4 可判定为沙门氏菌。 如有 2 项异常为非沙门氏菌。
表4 沙门氏菌属生化反应初步鉴别表
pH 7.2 尿素 | 氰化钾(KCN) | 赖氨酸脱羧酶 | 判 定 结 果 |
- | - | - | 甲型副伤寒沙门氏菌(要求血清学鉴定结果) |
- | + | + | 沙门氏菌Ⅳ或Ⅴ(要求符合本群生化特性) |
+ | - | + | 沙门氏菌个别变体(要求血清学鉴定结果) |
注:+表示阳性;+表示阴性。 |
反应序号 A2:补做甘露醇和山梨醇试验,沙门氏菌靛基质阳性变体两项试验结果均为阳 性,但需要结合血清学鉴定结果进行判定。
反应序号 A3:补做 ONPG。ONPG 阴性为沙门氏菌,同时赖氨酸脱羧酶阳性,甲型副伤寒 沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。
必要时按表 5 进行沙门氏菌生化群的鉴别。
表5 沙门氏菌属各生化群的鉴别
项 目 | Ⅰ | Ⅱ | Ⅲ | Ⅳ | Ⅴ | Ⅵ |
卫矛醇 | + | + | - | - | + | - |
山梨醇 | + | + | + | + | + | - |
水杨苷 | - | - | - | + | - | - |
ONPG | - | - | + | - | + | - |
丙二酸盐 | - | + | + | - | - | - |
KCN | - | - | - | + | + | - |
5.4.3 如选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统,可根据 5.4.1 的初步判断结果,从营 养琼脂平板上挑取可疑菌落,用生理盐水制备成浊度适当的菌悬液,使用生化鉴定试剂盒或全自动 微生物生化鉴定系统进行鉴定。
血清学鉴定
抗原的准备
一般采用 1.2%~1.5%琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。
O 血清不凝集时,将菌株接种在琼脂量较高的 (如 2%~3%) 培养基上再检查;如果是由于 Vi 抗原的存在而阻止了 O 凝集反应时,可挑取菌苔于 1 mL 生理盐水中做成浓菌液,于酒精灯火焰上煮沸后再检查。H 抗原发育不良时,将菌株接种在 0.55%~0.65%半固体琼脂平板的中央,俟菌落 蔓延生长时,在其边缘部分取菌检查;或将菌株通过装有 0.3%~0.4%半固体琼脂的小玻管 1 次~2 次,自远端取菌培养后再检查。
多价菌体抗原(O)鉴定
在玻片上划出 2 个约 1 cm×2 cm 的区域,挑取 1 环待测菌,各放 1/2 环于玻片上的每一区域上 部,在其中一个区域下部加 1 滴多价菌体(O)抗血清,在另一区域下部加入 1 滴生理盐水,作为对 照。再用无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌落研成乳状液。将玻片倾斜摇动混合 1 min,并对 着黑暗背景进行观察,任何程度的凝集现象皆为阳性反应。
多价鞭毛抗原(H)鉴定
5.5.2。
血清学分型(选做项目)
O 抗原的鉴定
用 A~F 多价 O 血清做玻片凝集试验,同时用生理盐水做对照。在生理盐水中自凝者为粗糙形 菌株,不能分型。
被 A~F 多价 O 血清凝集者,依次用 O4;O3、O10;O7;O8;O9;O2 和 O11 因子血清做凝集 试验。根据试验结果,判定 O 群。被 O3、O10 血清凝集的菌株,再用 O10、O15、O34、O19 单因 子血清做凝集试验,判定 E1、E2、E3、E4 各亚群,每一个 O 抗原成分的最后确定均应根据 O 单因 子血清的检查结果,没有 O 单因子血清的要用两个 O 复合因子血清进行核对。
不被 A~F 多价 O 血清凝集者,先用 9 种多价 O 血清检查,如有其中一种血清凝集,则用这种 血清所包括的 O 群血清逐一检查,以确定 O 群。每种多价 O 血清所包括的 O 因子如下:
O 多价 1 A,B,C,D,E,F,群 (并包括 6,14 群) O 多价 2 13,16,17,18,21 群
O 多价 3 28,30,35,38,39 群 O 多价 4 40,41,42,43 群
O 多价 5 44,45,47,48 群
O 多价 6 50,51,52,53 群
O 多价 7 55,56,57,58 群
O 多价 8 59,60,61,62 群
O 多价 9 63,65,66,67 群
H 抗原的鉴定
属于 A~F 各 O 群的常见菌型,依次用表 6 所述 H 因子血清检查第 1 相和第 2 相的 H 抗原。
表6 A~F 群常见菌型 H 抗原表
O 群 | 第 1 相 | 第 2 相 |
A | a | 无 |
B | g,f,s | 无 |
B | i,b,d | 2 |
C1 | k,v,r,c | 5,z15 |
C2 | b,d,r | 2,5 |
D( 不产气的) | d | 无 |
D(产气的) | g,m,p,q | 无 |
E1 | h,v | 6,w,x |
E4 | g,s,t | 无 |
E4 | i |
|
不常见的菌型,先用 8 种多价 H 血清检查,如有其中一种或两种血清凝集,则再用这一种或两种 血清所包括的各种 H 因子血清逐一检查,以第 1 相和第 2 项的 H 抗原。8 种多价 H 血清所包括的 H 因子如下:
H 多价 1 a,b,c,d,i
H 多价 2 eh,enx,enz15,fg,gms,gpu,gp,gq,mt,gz51 H 多价 3 k,r,y,z,z10,lv,lw,lz13,lz28,lz40
H 多价 4 1,2;1,5;1,6;1,7;z6
H 多价 5 z4z23,z4z24,z4z32,z29,z35,z36,z38 H 多价 6 z39,z41,z42,z44
H 多价 7 z52,z53,z54,z55
H 多价 8 z56,z57,z60,z61,z62
每一个 H 抗原成分的最后确定均应根据 H 单因子血清的检查结果,没有 H 单因子血清的要用两 个 H 复合因子血清进行核对。
检出第 1 相 H 抗原而未检出第 2 相 H 抗原的或检出第 2 相 H 抗原而未检出第 1 相 H 抗原的,可 在琼脂斜面上移种 1~2 代后再检查。如仍只检出一个相的 H 抗原,要用位相变异的方法检查其另一 个相。单相菌不必做位相变异检查。
位相变异试验方法如下:
小玻管法: 将半固体管(每管约 1 mL~2 mL) 在酒精灯上溶化并冷至 50 ℃,取已知相的 H 因子血清 0.05 mL~0.1 mL,加入于溶化的半固体内,混匀后,用毛细吸管吸取分装于供位相变异试 验的小玻管内,俟凝固后,用接种针挑取待检菌,接种于一端。将小玻管平放在平皿内,并在其旁 放一团湿棉花,以防琼脂中水分蒸发而干缩,每天检查结果,待另一相细菌解离后,可以从另一端 挑取细菌进行检查。培养基内血清的浓度应有适当的比例,过高时细菌不能生长,过低时同一相细 菌的动力不能抑制。一般按原血清 1:200~1:800 的量加入。
小倒管法:将两端开口的小玻管 (下端开口要留一个缺口,不要平齐) 放在半固体管内,小玻 管的上端应高出于培养基的表面,灭菌后备用。临用时在酒精灯上加热溶化,冷至 50 ℃,挑取因子 血清 1 环,加入小套管中的半固体内,略加搅动,使其混匀,俟凝固后,将待检菌株接种于小套管 中的半固体表层内,每天检查结果,待另一相细菌解离后,可从套管外的半固体表面取菌检查,或 转种 1%软琼脂斜面,于 37 ℃培养后再做凝集试验。
简易平板法:将 0.35%~0.4%半固体琼脂平板烘干表面水分,挑取因子血清 1 环,滴在半固体 平板表面,放置片刻,待血清吸收到琼脂内,在血清部位的中央点种待检菌株,培养后,在形成蔓 延生长的菌苔边缘取菌检查。
Vi 抗原的鉴定
用 Vi 因子血清检查。已知具有 Vi 抗原的菌型有:伤寒沙门氏菌,丙型副伤寒沙门氏菌,都柏林 沙门氏菌。
菌型的判定
根据血清学分型鉴定的结果,按照附录 B 或有关沙门氏菌属抗原表判定菌型。
结果与报告
综合以上生化试验和血清学鉴定的结果,报告25 g(mL)样品中检出或未检出沙门氏菌。
附录A
(规范性附录)
培养基和试剂
A.1 缓冲蛋白胨水(BPW)
A.1.1 成分
蛋白胨 10.0 g
氯化钠 5.0 g
磷酸氢二钠(含 12 个结晶水) 9.0 g
磷酸二氢钾 1.5 g
蒸馏水 1 000 mL
pH 7.2±0.2
A.1.2 制法
将各成分加入蒸馏水中,搅混均匀,静置约 10 min,煮沸溶解,调节 pH,高压灭菌 121 ℃,15 min。
A.2 四硫磺酸钠煌绿(TTB)增菌液
A.2.1 基础液
蛋白胨 10.0 g
牛肉膏 5.0 g
氯化钠 3.0 g
碳酸钙 45.0 g
蒸馏水 1000 mL
pH 7.0±0.2
除碳酸钙外,将各成分加入蒸馏水中,煮沸溶解,再加入碳酸钙,调节 pH,高压灭菌 121 ℃,20 min。
A.2.2 硫代硫酸钠溶液
硫代硫酸钠(含 5 个结晶水) 50.0 g
蒸馏水 加至 100 mL
高压灭菌 121 ℃,20 min。
A.2.3 碘溶液
碘 片 20.0 g
碘化钾 25.0 g
蒸馏水 加至 100 mL
将碘化钾充分溶解于少量的蒸馏水中,再投入碘片,振摇玻瓶至碘片全部溶解为止,然后加蒸 馏水至规定的总量,贮存于棕色瓶内,塞紧瓶盖备用。
A.2.4 0.5%煌绿水溶液
煌绿 0.5 g
蒸馏水 100 mL
溶解后,存放暗处,不少于 1d,使其自然灭菌。
A.2.5 牛胆盐溶液
牛胆盐 10.0 g
蒸馏水 100 mL
加热煮沸至完全溶解,高压灭菌 121 ℃,20 min。
A.2.6 制法
基础液 900 mL
硫代硫酸钠溶液 100 mL
碘溶液 20.0 mL
煌绿水溶液 2.0 mL
牛胆盐溶液 50.0 mL
临用前,按上列顺序,以无菌操作依次加入基础液中,每加入一种成分,均应摇匀后再加入另
一种成分。
A.3 亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液
A.3.1 成分
蛋白胨 5.0 g
乳糖 4.0 g
磷酸氢二钠 10.0 g
亚硒酸氢钠 4.0 g
L-胱氨酸 0.01 g
蒸馏水 1 000 mL
pH 7.0±0.2
A.3.2 制法
除亚硒酸氢钠和 L-胱氨酸外,将各成分加入蒸馏水中,煮沸溶解,冷至 55 ℃以下,以无菌操作 加入亚硒酸氢钠和 1 g/L L-胱氨酸溶液 10 mL(称取 0.1 g L-胱氨酸,加 1 mol/L 氢氧化钠溶液 15 mL,
使溶解,再加无菌蒸馏水至 100 mL 即成,如为 DL-胱氨酸,用量应加倍)。摇匀,调节 pH。
A.4 亚硫酸铋(BS)琼脂
A.4.1 成分
蛋白胨 10.0 g
牛肉膏 5.0 g
葡萄糖 5.0 g
硫酸亚铁 0.3 g
磷酸氢二钠 4.0 g
煌 绿 0.025 g 或 5.0g/L 水溶液 5.0mL
柠檬酸铋铵 2.0 g
亚硫酸钠 6.0 g
琼 脂 18.0 g~20 g
蒸馏水 1 000 mL
pH 7.5±0.2
A.4.2 制法
将前三种成分加入 300 mL 蒸馏水(制作基础液),硫酸亚铁和磷酸氢二钠分别加入 20 mL 和 30 mL 蒸馏水中,柠檬酸铋铵和亚硫酸钠分别加入另一 20 mL 和 30 mL 蒸馏水中,琼脂加入 600 mL 蒸 馏水中。然后分别搅拌均匀,煮沸溶解。冷至 80 ℃左右时,先将硫酸亚铁和磷酸氢二钠混匀,倒入 基础液中,混匀。将柠檬酸铋铵和亚硫酸钠混匀,倒入基础液中,再混匀。调节 pH,随即倾入琼脂 液中,混合均匀,冷至 50 ℃~55 ℃。加入煌绿溶液,充分混匀后立即倾注平皿。
注:本培养基不需要高压灭菌,在制备过程中不宜过分加热,避免降低其选择性,贮于室温暗处,超过 48 h 会降低其选择性,本培养基宜于当天制备,第二天使用。
A.5 HE 琼脂(Hektoen Enteric Agar)
A.5.1 成分
蛋白胨 12.0 g
牛肉膏 3.0 g
乳糖 12.0 g
蔗糖 12.0 g
水杨素 2 .0 g
胆盐 20.0 g
氯化钠 5.0 g
琼脂 18.0 g~20.0 g
蒸馏水 1 000 mL
0.4%溴麝香草酚蓝溶液 16.0 mL
Andrade 指示剂 20.0 mL
甲液 20.0 mL
乙液 20.0 mL
pH 7.5±0.2
A.5.2 制法
将前面七种成分溶解于 400 mL 蒸馏水内作为基础液;将琼脂加入于 600 mL 蒸馏水内。然后分别 搅拌均匀,煮沸溶解。加入甲液和乙液于基础液内,调节 pH。再加入指示剂,并与琼脂液合并,待冷至 50 ℃~55 ℃倾注平皿。
注:①本培养基不需要高压灭菌,在制备过程中不宜过分加热,避免降低其选择性。
②甲液的配制
硫代硫酸钠 34.0 g
柠檬酸铁铵 4.0 g
蒸馏水 100 mL
③乙液的配制
去氧胆酸钠 10.0 g
蒸馏水 100 mL
④ Andrade 指示剂
酸性复红 0.5 g
1mol/L 氢氧化钠溶液 16.0 mL
蒸馏水 100 mL
将复红溶解于蒸馏水中,加入氢氧化钠溶液。数小时后如复红褪色不全,再加氢氧化钠溶液 1 mL~2 mL。
A.6 木糖赖氨酸脱氧胆盐(XLD)琼脂
A.6.1 成分
酵母膏 3.0 g
L-赖氨酸 5.0 g
木糖 3.75 g
乳糖 7.5 g
蔗糖 7.5 g
去氧胆酸钠 2.5 g
柠檬酸铁铵 0.8 g
硫代硫酸钠 6.8 g
氯化钠 5.0 g
琼脂 15.0 g
酚红 0.08 g
蒸馏水 1 000 mL
pH 7.4±0.2
A.6.2 制法
除酚红和琼脂外,将其他成分加入 400 mL 蒸馏水中,煮沸溶解,调节 pH。另将琼脂加入 600 mL 蒸馏水中,煮沸溶解。
将上述两溶液混合均匀后,再加入指示剂,待冷至 50 ℃~55 ℃倾注平皿。 注:本培养基不需要高压灭菌,在制备过程中不宜过分加热,避免降低其选择性,贮于室温暗处。
本培养基宜于当天制备,第二天使用。
A.7 三糖铁(TSI)琼脂
A.7.1 成分
蛋白胨 20.0 g
牛肉膏 5.0 g
乳 糖 10.0 g
蔗 糖 10.0 g
葡萄糖 1.0 g
硫酸亚铁铵(含 6 个结晶水) 0.2 g
酚 红 0.025 g 或 5.0 g/L 溶液 5.0 mL
氯化钠 5.0 g
硫代硫酸钠 0.2 g
琼 脂 12.0 g
蒸馏水 1 000 mL
pH 7.4±0.2
A.7.2 制法
除酚红和琼脂外,将其他成分加入 400 mL 蒸馏水中,煮沸溶解,调节 pH。另将琼脂加入 600 mL 蒸馏水中,煮沸溶解。
将上述两溶液混合均匀后,再加入指示剂,混匀,分装试管,每管约 2 mL~4 mL,高压灭菌 121 ℃ 10 min 或 115 ℃ 15 min,灭菌后置成高层斜面,呈桔红色。
A.8 蛋白胨水、靛基质试剂
A.8.1 蛋白胨水
蛋白胨(或胰蛋白胨) 20.0 g
氯化钠 5.0 g
蒸馏水 1000 mL
pH 7.4±0.2
将上述成分加入蒸馏水中,煮沸溶解,调节 pH,分装小试管,121 ℃高压灭菌 15 min。
A.8.2 靛基质试剂
A.8.2.1 柯凡克试剂:将 5 g 对二甲氨基甲醛溶解于 75 mL 戊醇中,然后缓慢加入浓盐酸 25 mL。 A.8.2.2 欧-波试剂:将 1 g 对二甲氨基苯甲醛溶解于 95 mL95%乙醇内。然后缓慢加入浓盐酸 20 mL。
A.8.3 试验方法
挑取小量培养物接种,在 36 ℃±1 ℃培养 1 d~2 d,必要时可培养 4 d~5 d。加入柯凡克试剂约 0.5 mL,轻摇试管,阳性者于试剂层呈深红色;或加入欧-波试剂约 0.5 mL,沿管壁流下,覆盖于培养 液表面,阳性者于液面接触处呈玫瑰红色。
注:蛋白胨中应含有丰富的色氯酸。每批蛋白胨买来后,应先用已知菌种鉴定后方可使用。
A.9 尿素琼脂(pH 7.2)
A.9.1 成分
蛋白胨 1.0 g
氯化钠 5.0 g
葡萄糖 1.0 g
磷酸二氢钾 2.0 g
0.4%酚 红 3.0 mL
琼 脂 20.0 g
蒸馏水 1 000 mL
20%尿素溶液 100 mL
pH7.2±0.2
A.9.2 制法
除尿素、琼脂和酚红外,将其他成分加入 400 mL 蒸馏水中,煮沸溶解,调节 pH。另将琼脂加 入 600 mL 蒸馏水中,煮沸溶解。
将上述两溶液混合均匀后,再加入指示剂后分装,121 ℃高压灭菌 15 min。冷至 50 ℃~55 ℃, 加入经除菌过滤的尿素溶液。尿素的最终浓度为 2%。分装于无菌试管内,放成斜面备用。
A.9.3 试验方法
挑取琼脂培养物接种,在 36 ℃±1 ℃培养 24 h,观察结果。尿素酶阳性者由于产碱而使培养基变 为红色。
A.10 氰化钾 (KCN) 培养基
A.10.1 成分
蛋白胨 10.0 g
氯化钠 5.0 g
磷酸二氢钾 0.225 g
磷酸氢二钠 5.64 g
蒸馏水 1000 mL
0.5%氰化钾 20.0 mL
A.10.2 制法
将除氰化钾以外的成分加入蒸馏水中,煮沸溶解,分装后 121 ℃高压灭菌 15 min。放在冰箱内 使其充分冷却。每 100 mL 培养基加入 0.5%氰化钾溶液 2.0 mL(最后浓度为 1:10 000),分装于无菌 试管内,每管约 4 mL,立刻用无菌橡皮塞塞紧,放在 4 ℃冰箱内,至少可保存两个月。同时,将不加氰化 钾的培养基作为对照培养基,分装试管备用。
A.10.3 试验方法
将琼脂培养物接种于蛋白胨水内成为稀释菌液,挑取 1 环接种于氰化钾(KCN)培养基。并另挑取 1 环接种于对照培养基。在 36 ℃±1 ℃培养 1 d~2 d,观察结果。如有细菌生长即为阳性(不抑制),经 2 d 细菌不生长为阴性(抑制)。
注:氰化钾是剧毒药,使用时应小心,切勿沾染,以免中毒。夏天分装培养基应在冰箱内进行。试验失败的主要 原因是封口不严,氰化钾逐渐分解,产生氢氰酸气体逸出,以致药物浓度降低,细菌生长,因而造成假阳性反应。试验时对每一环节都要特别注意。
A.11 赖氨酸脱羧酶试验培养基
A.11.1 成分
蛋白胨 5.0 g
酵母浸膏 3.0 g
葡萄糖 1.0 g
蒸馏水 1000 mL
1.6%溴甲酚紫-乙醇溶液 1.0 mL
L-赖氨酸或 DL-赖氨酸 0.5 g/100 mL 或 1.0 g/100 mL
pH 6.8±0.2
A.11.2 制法
除赖氨酸以外的成分加热溶解后,分装每瓶 100 mL,分别加入赖氨酸。L-赖氨酸按 0.5%加入, DL-赖氨酸按 1%加入。调节 pH。对照培养基不加赖氨酸。分装于无菌的小试管内,每管 0.5 mL, 上面滴加一层液体石蜡,115 ℃高压灭菌 10 min。
A.11.3 试验方法
从琼脂斜面上挑取培养物接种,于 36 ℃±1 ℃培养 18 h~24 h,观察结果。氨基酸脱羧酶阳性者 由于产碱,培养基应呈紫色。阴性者无碱性产物,但因葡萄糖产酸而使培养基变为黄色。对照管应 为黄色。
A.12 糖发酵管
A.12.1 成分
牛肉膏 5.0 g
蛋白胨 10.0 g
氯化钠 3.0 g
磷酸氢二钠(含 12 个结晶水) 2.0 g
0.2%溴麝香草酚蓝溶液 12.0 mL
蒸馏水 1000 mL
pH 7.4±0.2
A.12.2 制法
A.12.2.1 葡萄糖发酵管按上述成分配好后,调节 pH。按 0.5%加入葡萄糖,分装于有一个倒置小
管的小试管内,121 ℃高压灭菌 15 min。
A.12.2.2 其他各种糖发酵管可按上述成分配好后,分装每瓶 100 mL,121 ℃高压灭菌 15 min。另将 各种糖类分别配好 10%溶液,同时高压灭菌。将 5 mL 糖溶液加入于 100 mL 培养基内,以无菌操作 分装小试管。
注:蔗糖不纯,加热后会自行水解者,应采用过滤法除菌。
A.12.3 试验方法:从琼脂斜面上挑取小量培养物接种,于 36 ℃±1 ℃培养,一般 2 d~3 d。迟缓反应 需观察 14 d~30 d。
A.13 ONPG 培养基
A.13.1 成分
邻硝基酚 β-D 半乳糖苷(ONPG) 60.0 mg
(O-Nitrophenyl-β-D-galactopyranoside)
0.01mol/L 磷酸钠缓冲液(pH7.5) 10.0 mL
1%蛋白胨水(pH7.5) 30.0 mL
A.13.2 制法
将 ONPG 溶于缓冲液内,加入蛋白胨水,以过滤法除菌,分装于无菌的小试管内,每管 0.5 mL, 用橡皮塞塞紧。
A.13.3 试验方法
自琼脂斜面上挑取培养物 1 满环接种于 36 ℃±1 ℃培养 1 h~3 h 和 24 h 观察结果。如果 β-半乳 糖苷酶产生,则于 1 h~3 h 变黄色,如无此酶则 24 h 不变色。
A.14 半固体琼脂
A.14.1 成分
牛肉膏 0.3 g
蛋白胨 1.0 g
氯化钠 0.5 g
琼脂 0.35g~0.4 g
蒸馏水 100 mL
pH 7.4±0.2
A.14.2 制法
按以上成分配好,煮沸溶解,调节 pH。分装小试管。121 ℃高压灭菌 15 min。直立凝固备用。 注:供动力观察、菌种保存、H 抗原位相变异试验等用。
A.15 丙二酸钠培养基
A.15.1 成分
酵母浸膏 1.0 g
硫酸铵 2.0 g
磷酸氢二钾 0.6 g
磷酸二氢钾 0.4 g
氯化钠 2.0 g
丙二酸钠 3.0 g
0.2%溴麝香草酚蓝溶液 12.0 mL
蒸馏水 1000 mL
pH 6.8±0.2
A.15.2 制法
除指示剂以外的成分溶解于水,调节 pH,再加入指示剂,分装试管,121 ℃高压灭菌 15 min。
A.15.3 试验方法
用新鲜的琼脂培养物接种,于36 ℃±1 ℃培养48 h,观察结果。阳性者由绿色变为蓝色。
附录 B (规范性附录) 常见沙门氏菌抗原
B.1 常见沙门氏菌抗原
常见沙门氏菌抗原见表 B.1。
表 B.1 常见沙门氏菌抗原表
|
| O 抗原 | H 抗原 |
菌名 | 拉丁菌名 | 第 1 相 | 第 2 相 |
A 群 |
甲型副伤寒沙门氏菌 | S. paratyphi A | 1,2,12 | a | [1,5] |
|
|
|
|
|
B 群 |
基桑加尼沙门氏菌 | S .kisangani | 1,4,[5],12 | a | 1,2 |
阿雷查瓦莱塔沙门氏菌 | S. arechavaleta | 4,[5],12 | a | 1,7 |
马流产沙门氏菌 | S. abortusequi | 4,12 | - | e,n,x, |
乙型副伤寒沙门氏菌 | S. paratyphi B | 1,4,[5],12 | b | 1,2 |
利密特沙门氏菌 | S. limete | 1,4,12,[27] | b | 1,5 |
阿邦尼沙门氏菌 | S. abony | 1,4,[5],12,27 | b | e,n,x |
维也钠沙门氏菌 | S. wien | 1,4,12,[27] | b | l,w |
伯里沙门氏菌 | S .bury | 4,12,[27] | c | z6 |
斯坦利沙门氏菌 | S. stanley | 1,4,[5],12,[27] | d | 1,2 |
圣保罗沙门氏菌 | S. saintpaul | 1,4,[5],12 | e,h | 1,2 |
里定沙门氏菌 | S .reading | 1,4,[5],12 | e,h | 1,5 |
彻斯特沙门氏菌 | S. chester | 1,4,[5],12 | e,h | e,n,x |
德尔卑沙门氏菌 | S. derby | 1,4,[5],12 | f,g | [1,2] |
阿贡纳沙门氏菌 | S. agona | 1,4,[5],12 | f,g,s | [1,2] |
埃森沙门氏菌 | S. essen | 4,12 | g,m | - |
加利福尼亚沙门氏菌 | S. california | 4,12 | g,m,t | [z67] |
金斯敦沙门氏菌 | S. kingston | 1,4,[5],12,[27] | g,s,t | [1,2] |
布达佩斯沙门氏菌 | S. budapest | 1,4,12,[27] | g,t | - |
鼠伤寒沙门氏菌 | S. typhimurium | 1,4,[5],12 | i | 1,2 |
拉古什沙门氏菌 | S. Lagos | 1,4,[5],12 | i | 1,5 |
布雷登尼沙门氏菌 | S.bredeney | 1,4,12,[27] | l,v | 1,7 |
基尔瓦沙门氏菌Ⅱ | S.kilwa Ⅱ | 4,12 | l,w | e,n,x |
海德尔堡沙门氏菌 | S.heidelberg | 1,4,[15],12 | r | 1,2 |
印地安纳沙门氏菌 | S.indiana | 1,4,12 | z | 1,7 |
斯坦利维尔沙门氏菌 | S.stanleyville | 1,4,[5],12.[27] | z4,z23 | [1,2] |
伊图里沙门氏菌 | S.ituri | 1,4,12 | z10 | 1,5 |
C1 群 |
奥斯陆沙门氏菌 | S.oslo | 6,7,14 | a | e,n,x |
爱丁保沙门氏菌 | S.edinburg | 6,7, 14 | b | 1,5 |
布隆方丹沙门氏菌Ⅱ | S.bloemfonteinⅡ | 6,7 | b | [e,n,x]:z42 |
丙型副伤寒沙门氏菌 | S.paratyphi C | 6,7,[Vi] | c | 1,5 |
猪霍乱沙门氏菌 | S.choleraesuis | 6,7 | c | 1,5 |
猪伤寒沙门氏菌 | S.typhisuis | 6,7 | c | 1,5 |
罗米他沙门氏菌 | S.lomita | 6,7 | e,h | 1,5 |
布伦登卢普沙门氏菌 | S.braenderup | 6,7, | e,h | e,n,z15 |
里森沙门氏菌 | S.rissen | 6,7, 14 | f,g | - |
蒙得维的亚沙门氏菌 | S.montevideo | 6,7, 14 | g,m,[p],s | [1,2,7] |
里吉尔沙门氏菌 | S.riggil | 6,7 | g,[t] | - |
奥雷宁堡沙门氏菌 | S.oranieburg | 6,7, 14 | m,t | [2,5,7] |
奥里塔蔓林沙门氏菌 | S.oritamerin | 6,7 | i | 1,5 |
汤卜逊沙门氏菌 | S.thompson | 6,7, 14 | k | 1,5 |
康科德沙门氏菌 | S.concord | 6,7 | l,v | 1,2 |
伊鲁木沙门氏菌 | S.irumu | 6,7 | l,v | 1,5 |
姆卡巴沙门氏菌 | S.mkamba | 6,7 | l,v | 1,6 |
波恩沙门氏菌 | S.bonn | 6,7 | l,v | e,n,x |
波茨坦沙门氏菌 | S.potsdam | 6,7, | l,v | e,n,z15 |
格但斯克沙门氏菌 | S.gdansk | 6,7, | l,v | z6 |
维尔肖沙门氏菌 | S.virchow | 6,7, 14 | r | 1,2 |
婴儿沙门氏菌 | S.infantis | 6,7, 14 | r | 1,5 |
巴布亚沙门氏菌 | S.papuana | 6,7 | r | e,n,z15 |
巴累利沙门氏菌 | S.bareilly | 6,7, 14 | y | 1,5 |
哈特福德沙门氏菌 | S.hartford | 6,7 | y | e,n,x |
三河岛沙门氏菌 | S.mikawasima | 6,7, | y | e,n,z15 |
姆班达卡沙门氏菌 | S.mbandaka | 6,7, | z10 | e,n,z15 |
田纳西沙门氏菌 | S.tennessee | 6,7, | z29 | [1,2,7] |
布伦登卢普沙门氏菌 | S.braenderup | 6,7, | e,h | e,n,z15 |
耶路撒冷沙门氏菌 | S.jerusalem | 6,7, | z10 | l,w |
C2 群 |
习志野沙门氏菌 | S.narashino | 6.8 | a | e,n,x |
名古屋沙门氏菌 | S.nagoya | 6,8 | b | 1,5 |
加瓦尼沙门氏菌 | S.gatuni | 6,8 | b | e,n,x |
慕尼黑沙门氏菌 | S.muenchen | 6,8 | d | 1,2 |
蔓哈顿沙门氏菌 | S.manhattan | 6,8 | d | 1,5 |
纽波特沙门氏菌 | S.newport | 6,8,20 | e,h | 1,2 |
科特布斯沙门氏菌 | S.kottbus | 6,8 | e,h | 1,5 |
茨昂威沙门氏菌 | S.tshiongwe | 6,8 | e,h | e,n,z15 |
林登堡沙门氏菌 | S.lindenburg | 6,8 | i | 1,2 |
塔科拉迪沙门氏菌 | S.takoradi | 6,8 | i | 1,5 |
波那雷恩沙门氏菌 | S.bonariensis | 6,8 | i | e,n,x |
利齐菲尔德沙门氏菌 | S.litchfield | 6,8 | l,v | 1,2 |
病牛沙门氏菌 | S.bovismorbificans | 6,8, 20 | r,[i] | 1,5 |
查理沙门氏菌 | S.chailey | 6,8 | z4,z23 | e,n,z15 |
C3 群 |
巴尔多沙门氏菌 | S.bardo | 8 | e,h | 1,2 |
依麦克沙门氏菌 | S.emek | 8,20 | g,m,s | - |
肯塔基沙门氏菌 | S.kentucky | 8, | i | z6 |
D 群 |
仙台沙门氏菌 | S.sendai | 1,9,12 | a | 1,5 |
伤寒沙门氏菌 | S.typhi | 9,12,[Vi] | d | - |
塔西沙门氏菌 | S.tarshyne | 9,12 | d | 1,6 |
伊斯特本沙门氏菌 | S.eastbourne | 1,9,12 | e,h | 1,5 |
以色列沙门氏菌 | S.israel | 9,12 | e,h | e,n,z15 |
肠炎沙门氏菌 | S.enteritidis | 1,9,12 | g,m | [1,7] |
布利丹沙门氏菌 | S.blegdam | 9,12 | g,m,q | - |
沙门氏菌 Ⅱ | Salmonella Ⅱ | 1,9,12 | g,m,[s],t | [1,5,7] |
都柏林沙门氏菌 | S.dublin | 1,9,12,[Vi] | g,p | - |
芙蓉沙门氏菌 | S.seremban | 9,12 | i | 1,5 |
巴拿马沙门氏菌 | S.panama | 1,9,12 | l,v | 1,5 |
戈丁根沙门氏菌 | S.goettingen | 9,12 | l,v | e,n,z15 |
爪哇安纳沙门氏菌 | S.javiana | 1,9,12 | L,z28 | 1,5 |
鸡-雏沙门氏菌 | S.gallinarum-pullorum | 1,9,12 | - | - |
E1 群 |
奥凯福科沙门氏菌 | S.okefoko | 3,10 | c | z6 |
瓦伊勒沙门氏菌 | S.vejle | 3,{10},{15} | e,h | 1,2 |
明斯特沙门氏菌 | S.muenster | 3,{10}{15}{15,34} | e,h | 1,5 |
鸭沙门氏菌 | S.anatum | 3, {10}{15}{15,34} | e,h | 1,6 |
纽兰沙门氏菌 | S.newlands | 3,{10},{15,34} | e,h | e,n,x |
火鸡沙门氏菌 | S.meleagridis | 3, {10}{15}{15,34} | e,h | l,w |
雷根特沙门氏菌 | S.regent | 3,10 | f,g,[s] | [1,6] |
西翰普顿沙门氏菌 | S.westhampton | 3,{10}{15}{15,34} | g,s,t | - |
阿姆德尔尼斯沙门氏菌 | S.amounderness | 3,10 | i | 1,5 |
新罗歇尔沙门氏菌 | S.new-rochelle | 3,10 | k | l,w |
恩昌加沙门氏菌 | S.nchanga | 3,{10}{15} | l,v | 1,2 |
新斯托夫沙门氏菌 | S.sinstorf | 3,10 | l,v | 1,5 |
伦敦沙门氏菌 | S.london | 3,{10}{15} | l,v | 1,6 |
吉韦沙门氏菌 | S.give | 3,{10}{15}{15,34} | l,v | 1,7 |
鲁齐齐沙门氏菌 | S.ruzizi | 3,10 | l,v | e,n,z15 |
乌干达沙门氏菌 | S.uganda | 3,{10}{15} | l,z13 | 1,5 |
乌盖利沙门氏菌 | S.ughelli | 3,10 | r | 1,5 |
韦太夫雷登沙门氏菌 | S.weltevreden | 3,{10}{15} | r | z6 |
克勒肯威尔沙门氏菌 | S.clerkenwell | 3,10 | z | l,w |
列克星敦沙门氏菌 | S.lexington | 3,{10}{15}{15,34} | z10 | 1,5 |
E4 群 |
萨奥沙门氏菌 | S.sao | 1,3,19 | e,h | e,n,z15 |
卡拉巴尔沙门氏菌 | S.calabar | 1,3,19 | e,h | l,w |
山夫登堡沙门氏菌 | S.senftenberg | 1,3,19 | g,[s],t | - |
斯特拉特福沙门氏菌 | S.stratford | 1,3,19 | i | 1,2 |
塔克松尼沙门氏菌 | S.taksony | 1,3,19 | i | z6 |
索恩保沙门氏菌 | S.schoeneberg | 1,3,19 | z | e,n,z15 |
F 群 |
昌丹斯沙门氏菌 | S.chandans | 11 | d | [e,n,x] |
阿柏丁沙门氏菌 | S.aberdeen | 11 | i | 1,2 |
布里赫姆沙门氏菌 | S.brijbhumi | 11 | i | 1,5 |
威尼斯沙门氏菌 | S.veneziana | 11 | i | e,n,x |
阿巴特图巴沙门氏菌 | S.abaetetuba | 11 | k | 1,5 |
鲁比斯劳沙门氏菌 | S.rubislaw | 11 | r | e,n,x |
其 他 群 |
浦那沙门氏菌 | S.poona | 1,13,22 | z | 1,6 |
里特沙门氏菌 | S.ried | 1,13,22 | z4,z23 | [e,n,z15] |
密西西比沙门氏菌 | S.mississippi | 1,13,23 | b | 1,5 |
古巴沙门氏菌 | S.cubana | 1,13,23 | z29 | - |
苏拉特沙门氏菌 | S.surat | [1],6,14,[25] | r,[i] | e,n,z15 |
松兹瓦尔沙门氏菌 | S.sundsvall | [1],6,14,[25] | z | e,n,x |
非丁伏斯沙门氏菌 | S.hvittingfoss | 16 | b | e,n,x |
威斯敦沙门氏菌 | S.weston | 16 | e,h | z6 |
上海沙门氏菌 | S.shanghai | 16 | l,v | 1,6 |
自贡沙门氏菌 | S.zigong | 16 | l,w | 1,5 |
巴圭达沙门氏菌 | S.baguida | 21 | z4,z23 | - |
迪尤波尔沙门氏菌 | S.dieuoppeul | 28 | i | 1,7 |
卢肯瓦尔德沙门氏菌 | S.luckenwalde | 28 | z10 | e,n,z15 |
拉马特根沙门氏菌 | S.ramatgan | 30 | k | 1,5 |
阿德莱沙门氏菌 | S.adelaide | 35 | f,g | - |
旺兹沃思沙门氏菌 | S.wandsworth | 39 | b | 1,2 |
雷俄格伦德沙门氏菌 | S.riogrande | 40 | b | 1,5 |
莱瑟沙门氏菌 | S.lethe Ⅱ | 41 | g,t | - |
达莱姆沙门氏菌 | S.dahlem | 48 | k | e,n,z15 |
沙门氏菌 IIIb | Salmonella Ⅲb | 61 | l,v | 1,5,7 |