菌株初筛:包括玻片凝集实验、氧化酶试验
玻片凝集实验
从分离培养基上挑取疑似菌落接种于非选择性培养基进行纯培养(37℃ 18-24h),取培养物与O1群霍乱诊断用单克隆抗体或O1群多价诊断血清及O139群霍乱弧菌诊断用单克隆抗体或诊断血清做破片凝集试验进行O1群和O139群霍乱弧菌的初筛。
玻片凝集试验使用的血清效价范围应为1:32-1:64。如玻片凝集试验在1min内出现肉眼可见的明显凝集块,但在生理盐水中不产生凝集的培养菌判为凝集阳性;应立即保存菌株做复核与分型鉴定;在1min内不出现凝集块者判为凝集阴性。
生长在碱性营养琼脂、庆大霉素琼脂及四号琼脂上的疑似菌落如足够大,可直接挑取疑似菌落与O1群霍乱弧菌多价诊断血清及0139群霍乱弧菌诊断血清做玻片凝集试验进行初筛。但生长在TCBS培养基上的疑似菌落常因培养基中蔗糖的影响造成难于乳化,不能直接进行玻片凝集试验,应先以非选择性培养基纯培养后再作玻片凝集。
要注意同一标本在O1群和O139群等多个血清群霍乱弧菌混合的可能,每份标本至少挑选5个以上可以菌落逐一进行鉴定。
氧化酶试验
试剂:1%盐酸对氨基二甲苯胺或盐酸二甲基对笨二胺水溶液。
试验方法:取生长在非选择性培养基上的新鲜培养物涂抹在洁净滤纸上,然后滴加上述试剂,如培养物在1min-2min内出现粉红-紫红-紫兰色,有的最后呈紫黑色,判断为氧化酶试验阳性
;培养物不显色判为阴性。
菌株复核
经初筛阳性或可疑阳性的菌株,在发出初步鉴定报告同时,应尽快送当地疾病预防控制中心进行复核鉴定。复核结果符合O1群或O139群霍乱弧菌的菌株,按菌株管理的要求进行保存与上送;如复核结果出现疑问,应尽快将菌株上送省级或省级以上CDC(参比实验室)进行确认分析。菌株复核鉴定应以纯培养物为基础,至少应包括以下项目:血清凝集试验与血清分型、革兰染色、黏丝试验、氧化酶试验、动力试验。对一次流行的首批病例菌株和玻片凝集反应不典型的菌株应增做试管凝集试验
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