DNA指纹图谱检定流程
（以人类口腔细胞检定为例）
【实验材料、仪器及试剂】
1. 人类口腔细胞。
2．仪器：微量移液器，小型离心机，恒温水浴锅，漩涡振荡器，PCR仪，电泳仪，电泳槽，透射式紫外分析仪（或凝胶成像仪）。枪头，1.5mL，0.2 mL离心管，棉签，使用前均需121℃高温灭菌
3．试剂：NaCl，琼脂糖，溴化乙锭，Na2-EDTA，SDS，Tris，Proteinase K，冰醋酸，溴酚蓝，二甲苯腈蓝，蔗糖，甘油，DNA相对分子质量标记，Chelex 100树脂（Bio-Rad），PCR pre-mix(TaKaRa)。
4.溶液配制
（1）5% Chelex树脂：Chelex 100(Bio-Rad) 0.5g、50mmol/L Tris-HCl 10mL、用4mol/L NaOH调pH至，室温可保存3个月，使用前充分混匀。
（2）2.0％琼脂糖凝胶：称2.0g琼脂糖放入250ml三角烧瓶，加入1× TAE溶液100mL微波炉加热溶解，冷却至60℃左右加入1μg/mL溴化乙锭，缓慢混匀后倒胶板。
（3）溴化乙锭：用无菌水配制5mg/mL储藏液，工作浓度1μg/mL。 注意；溴化乙锭为诱变剂，有致癌作用。配制、稀释和染色时必须戴手套。
（4）0.5mol/L EDTA(pH8.0)：Na2-EDTA 18.61g、NaOH 2g，蒸馏水定容至100mL，室温保存。
（5）10×TAE电泳缓冲液：Tris 48.4g、冰醋酸11.42mL、0.5mol/L EDTA(pH8.0) 20mL，蒸馏水定容至1000mL，室温保存。
（6）10×上样缓冲液（Loading dye）：溴酚蓝 0.25g、二甲苯腈蓝 0.25g、蔗糖 50.00g（或甘油50mL），用60mL无菌水（用甘油50mL时，49mL）溶解上述试剂，再定至100mL,室温保存即可。
（7） 10%SDS：SDS 10g用无菌水溶解后（可加热），定容至100mL，室温保存。
（8）蛋白酶K溶液：20mg/mL蛋白酶K水溶液 5mL、10%SDS 1mL、无菌水 94mL，冰箱冷藏。
（9）无菌水：蒸馏水或去离子水，高温灭菌。
（10）1mol/L Tris-HCl(pH8.0)：将12.1g Tris溶解在80mL蒸馏水中， 加盐酸调节pH至8.0，加蒸馏水定容至100mL。
5．引物 Primer1：5’-GAAACTGGCCTCCAAACACTGCCCGCCG-3’
Primer2：5’-GTCTTGTTGGAGATGCACGTGCCCCTTGC-3’
【实验流程】
1、收集DNA样本
（1）先漱口，然后用灭菌的牙签充分擦刮口腔内壁，将该牙签放入1.5mL 装有1mL无菌水的小离心管中，使粘附在牙签表面的口腔细胞悬浮其中（以能看到悬浮物为好）。震荡10s，10000 r/min离心1min。
（2）从离心管中吸出970μL无菌水，注意不要吸到沉淀。
（3）向离心管中加入200μL 5% Chelex 100，震荡10s混匀。
（4）加入2μL蛋白酶K，混匀，56℃保温5min。
（5）剧烈震荡10s,沸水浴8min。
（6）10000r/min离心3min，离心管中溶液分成上下两层：下层为Chelex100和细胞碎片的沉淀，上层溶液含DNA分子，可以直接用作PCR模板。 此DNA样本可在4℃或-20℃保存，必要时可在使用前再次加热并离心，使管内物质分层。
2．PCR扩增D1S80等位基因
（1）每个人用记号笔在0.2mL PCR管上做好标记。
（2）准备冰盒，开始反应前尽量使PCR管保持在冰上。
（3）依次加入下列成分，配制25μL体系的PCR反应溶液：PCR pre-mix 12.5μL 引物11μL 引物21μL 口腔细胞DNA样10μL 加无菌水至总体积25uL。
（4）轻弹管壁，混匀溶液。
（5）离心10s，使管壁上的液滴落下。
（6）按下列程序开始PCR反应： 94℃，1 min $ 94℃，15s 68℃，15s 72℃，15 s 30个循环 $ 72℃，10min $ 4℃暂时放置，直至开始电泳
3．PCR扩增产物鉴定与D1S80等位基因分析
（1）准备冰盒。
（2）取出完成反应的PCR管，放冰上待用。
（3）取出10µLD1S80 PCR扩增产物放入0.5mL离心管。 （4）加入2µL上样缓冲液。
（4）轻弹管壁混匀，再瞬时离心，使管壁上的液滴下落。
（5）用1×电泳缓冲液配制2.0%琼脂糖电泳凝胶。
（6）60V预电泳1～2min。
（7）在凝胶上选一孔加6µLDNA相对分子质量标记（DNA100bpLadder）。
（8）每人将刚刚准备好的10µLD1S80 PCR扩增产物+2 uL的上样缓冲液各自加入凝胶样孔，注意不要有气泡进入。
（9）60V电泳30～40min。
（10）取出凝胶用清水漂洗5～10min。
（11）凝胶用紫外分析仪观察，记录每个个体的DNA条带数目及其位置。
4．观察和分析D1S80多态性。
【结果与分析】
本次实验所选择的方法是D1S80指纹图谱分析的常用方法。人群中D1S80座位的杂合率约为86％。从理论上讲，可能存在435种不同的等位基因组合。利用D1S80座位两侧序列设计的引物（Kasai et al，1990），通过PCR反应，很容易确定特定个体的D1S80等位基因构成，纯合体只有一条DNA带，而杂合体有两条不同的DNA带。 1．将小组的电泳结果拍照 2．根据电泳结果，填写D1S80等位基因分析结果
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