通过文献检索得到相关案例《3种中药注射剂无菌检查方法的建立和结果评价》，实验旨在在按药典要求对舒血宁注射液、穿心莲注射液和银杏叶提取物注射液进行无菌方法学验证，以本实验为例简单介绍无菌检测方法的确认过程。
1、验证菌种
金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉。
2、培养基及冲洗液
硫乙醇酸盐流体培养基，改良马丁培养基，营养肉汤培养基，改良马丁琼脂培养基，营养琼脂培养基，0.1%蛋白胨水溶液，均按照《中国药典》中无菌检查法项下要求配制。
3、待测品
舒血宁注射液、穿心莲注射液、银杏叶提取物注射液。
4 、仪器和滤器
无菌隔离器 、集菌仪和一次性使用的全封闭三联集菌培养器、生化培养箱、生物安全柜、高压蒸汽灭菌器。
5、菌液制备
按照《中国药典》无菌检查法对照菌液配制，最终制备的菌液浓度每 1ml含10 ～100个菌( cfu)，同时进行平板计数。
接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中或胰酪大豆胨琼脂培养基上，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30-35°C培养18-24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中或沙氏葡萄糖琼脂培养基上，20-25°C培养 24-4 8小时，上述培养物用PH7.0 无菌氣化钠-蛋白胨缓冲液或0. 9%无菌氣化钠溶液制成每lm l含菌数小于lOOcfu(菌落形成单位）的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，20-25C培养5-7 天，加人35ml含0.05% (ml/ml)聚山梨酯8 0的pH7. 0 无菌氣化钠-蛋白胨缓冲液或0. 9 % 无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05% (ml /ml )聚山梨醋 80 的pH7. 0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9 % 无菌氣化钠溶液制成每lml含孢子数小于lOOcfu的孢子悬液。菌悬液若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在28°C可在24小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在28°C，在验证过的贮存期内使用。
6、 样品取样
3种中药注射剂均为液体制剂，规格为2 ml或5ml，一次试验中一组三联集菌培养器(其中1个滤筒检查细菌、1个滤筒检查真菌、1个滤筒作为阳性对照)需要的样品量最少应为30支。过滤样品溶液前，先经少量0. 1%蛋白胨水溶液润湿滤器排空，再进行样品溶液的过滤。
7、中药注射剂的无菌检查方法学验证
薄膜过滤法，取一次性全封闭集菌培养器( 三联) ，先用冲洗液( 0. 1%无菌蛋白胨水溶液) 润湿滤膜，取规定量的供试液全部通过3 个滤器，滤干后用冲洗液冲洗一次，每次每膜 100 ml，过滤后2 个滤筒加入硫乙醇酸盐流体培养基各100 ml，另1个滤筒加改良马丁培养基 100 ml，平行两份，分别加入上述 6 种验证菌株( 10 ～100cfu) ，作为试验组; 另取一装有同体积相同培养基的滤筒，加入等量试验菌，作为阳性对照组，硫乙醇酸盐流体培养基的滤筒置 33℃ 培养，改良马丁培养基置25℃培养，观察验证菌生长情况。
直接接种法，最少的培养基的量( 硫乙醇酸盐流体培养基 15ml 和改良马丁培养基10ml ) ，样品接种量为1ml，加入阳性菌( 10 ～100cfu) ，培养16h 后，结果发现，与阳性菌对照( 用0.1%蛋白胨水溶液代替样品) 相比，舒血宁注射液的金黄色葡萄球菌长的菌柱数或是其长度要差很多，其余试验菌株相差不明显，说明舒血宁注射液对金黄色葡萄球菌有微弱的抑菌作用，而穿心莲注射液和银杏叶提取物注射液的所有菌株与阳性对照组相比几乎没有差异，说明它们对试验菌株没有抑菌作用或抑菌作用可以忽略不计，但它们本身带一定的颜色，结合药典附录要求首选薄膜过滤法，用0.1%无菌蛋白胨水溶液冲洗1 次，去除样品本身的颜色或可能存在的抑菌作用。
8、得出结果
样品本身和阴性对照组均无菌生长，试验组各滤筒中试验菌与阳性对照组比较均生长良好，说明三种中药注射剂的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计，上述检查方法可行。